微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1微生物分子生態(tài)學(xué)研究微生物分子生態(tài)學(xué)研究(ynji)方法方法第一頁，共54頁。p群落結(jié)構(gòu)決定了生態(tài)功能的特性(txng)和強(qiáng)弱。p群落結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)生態(tài)功能的重要因素。p群落結(jié)構(gòu)變化是標(biāo)記環(huán)境變化的重要方面。通過對環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行解析并研究其動(dòng)態(tài)變化，可以為調(diào)節(jié)群落功能和發(fā)現(xiàn)新的重要微生物功能類群提供可靠(kko)的依據(jù)。 第1頁/共53頁第二頁，共54頁。微生物群落微生物群落(qnlu)結(jié)構(gòu)和多樣性研究方法：結(jié)構(gòu)和多樣性研究方法：在70和80年代：對微生物(shngw)化學(xué)成分的分析，建立了一些微生物(shngw)分類和定量的方法（生物(shngw)標(biāo)記物方法），

2、對環(huán)境微生物(shngw)群落結(jié)構(gòu)及多樣性的認(rèn)識進(jìn)入到較客觀的層次上。在80和90年代：現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以DNA為目標(biāo)物，通過rRNA基因測序技術(shù)和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺傳的多樣性，并給出了關(guān)于群落結(jié)構(gòu)的直觀信息。第2頁/共53頁第三頁，共54頁。雖然可以檢測環(huán)境中的活細(xì)胞，并且對微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展(fzhn)起了很重要的作用。采用配比簡單的營養(yǎng)基質(zhì)和固定的培養(yǎng)溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環(huán)境與原生境的偏差使得可培養(yǎng)的種類大大減少 （不到1 % ）。Amann 等人報(bào)道在自然環(huán)境樣品中可培養(yǎng)的微生物占總的微生物數(shù)量的比例范圍從0.001%（

3、海水）到0.3%（土壤）。 不能全面地反映微生物區(qū)系組成狀況，煩瑣、耗時(shí)。1、傳統(tǒng)、傳統(tǒng)(chuntng)的微生物培養(yǎng)法的微生物培養(yǎng)法第3頁/共53頁第四頁，共54頁。2、群落、群落(qnlu)水平生理學(xué)指紋方法水平生理學(xué)指紋方法(CLPP)微生物所含的酶與其豐度或活性是密切相關(guān)的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質(zhì)，則這種酶-底物可作為此群落的生物標(biāo)記分子之一。由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理學(xué)指紋方法(CLPP)，通過檢測微生物樣品對底物利用模式來反映種群組成的酶活性的分析方法。具體而言，CLPP就是通過檢測微生物樣品對多種不同的單一碳源的利用能

4、力，來確定哪些基質(zhì)可以作為能源，從而產(chǎn)生(chnshng)對基質(zhì)利用的生理代謝指紋。 第4頁/共53頁第五頁，共54頁。自動(dòng)化、快速自動(dòng)化、快速(kui s) 可鑒定細(xì)菌可鑒定細(xì)菌(xjn)(xjn)有有11401140多種、酵母菌多種、酵母菌267267種種、目前已經(jīng)可用于絲狀真、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。菌。每個(gè)孔中含有每個(gè)孔中含有不同的底物不同的底物菌懸液或菌懸液或無菌水無菌水第5頁/共53頁第六頁，共54頁。優(yōu)點(diǎn)：不需要把微生物的細(xì)胞從環(huán)境樣中分離，能克服由于(yuy)培養(yǎng)而導(dǎo)致的微生物種群變化，具有一定的客觀性。第6頁/共53頁第七頁，共54頁。醌指紋醌指紋(zhwn)法法(Quino

5、nes Profiling)第7頁/共53頁第八頁，共54頁。磷脂磷脂(ln zh)脂肪酸（脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲）、甲基脂肪酸酯（基脂肪酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）譜圖分析）譜圖分析脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)(y jing)被作為微生物分類的依據(jù)。甲基脂肪酸酯是細(xì)胞膜磷脂水解產(chǎn)物，氣相色譜分析系統(tǒng)分析出全細(xì)胞的FAME譜圖。脂肪酸譜圖法分類水平較低，不能鑒定到種。另外，不同微生物種屬之間脂肪酸組成有重疊，外來生物污染也限制了脂肪酸譜圖法對種群結(jié)構(gòu)解析的可靠性。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂

6、脂肪酸部分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出PLFA譜圖。第8頁/共53頁第九頁，共54頁。第9頁/共53頁第十頁，共54頁。第10頁/共53頁第十一頁，共54頁。第11頁/共53頁第十二頁，共54頁。在微生物群落中，各細(xì)菌數(shù)量占1-10%時(shí)，其特征性ERIC-PCR主條帶就可以在指紋圖中表現(xiàn)出來。ERIC-PCR指紋圖中，每一條帶可以是來自若干種不同(b tn)微生物的基因組DNA片段，條帶的數(shù)目反映微生物類群的多少，條帶的亮度反映該類群微生物種群數(shù)量的高低。分析不同環(huán)境樣品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指紋(zhwn)圖譜的差異，就可比較不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的差異，或者同一個(gè)群落在

7、不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化。第12頁/共53頁第十三頁，共54頁。E1: 5-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3E2: 5-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3ERIC-PCR引物20 pmol/l 第13頁/共53頁第十四頁，共54頁。第14頁/共53頁第十五頁，共54頁。用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析的基因組DNA的序列包括：核糖體操縱子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重復(fù)序列和隨機(jī)基因組序列等。最常用的標(biāo)記序列是核糖體操縱子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在細(xì)胞中相對穩(wěn)定(wndng)，同時(shí)含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類的一個(gè)重要指標(biāo)。第15頁

8、/共53頁第十六頁，共54頁。Diversity estimation based on molecular markers第16頁/共53頁第十七頁，共54頁。第17頁/共53頁第十八頁，共54頁。lPresent in all life molecular chronometer taxonomy (large database) evolutionlone active bacterial cell: 104 copies 15 rRNA genes (i.e., rDNA)(Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Sulfo

9、lobus solfataricus with 1 copy, Clostridium paradoxum with 15 copies)l1500 nt (enough information)four different domains conserved regions (no variation among all life)variable regions (V1-V9)Source: Louis, B., Gene IV, 1997第18頁/共53頁第十九頁，共54頁。第19頁/共53頁第二十頁，共54頁。第20頁/共53頁第二十一頁，共54頁。第21頁/共53頁第二十二頁，共54

10、頁。第22頁/共53頁第二十三頁，共54頁。第23頁/共53頁第二十四頁，共54頁。陽性(yngxng)克隆篩選的過程：抗性，挑選出含有質(zhì)粒的克隆2.藍(lán)白斑篩選，挑出帶有插入片段的克隆篩選，挑出帶有正確長度插入片段的克隆第24頁/共53頁第二十五頁，共54頁。各OTU含有(hn yu)的克隆數(shù)量第25頁/共53頁第二十六頁，共54頁。第26頁/共53頁第二十七頁，共54頁。Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)16S rDNAFragment Size (base pairs)ABCRelative Intensit

11、yLiu et al., 1997, AEM第27頁/共53頁第二十八頁，共54頁。第28頁/共53頁第二十九頁，共54頁。DGGE/TGGE 技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入(jir)了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA 片段區(qū)分開來。一個(gè)特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(melting domain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。一個(gè)幾百個(gè)堿基對的DNA 片段一般有幾個(gè)解鏈區(qū)域，每個(gè)解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加各區(qū)域依次發(fā)生解鏈。第29頁/共53頁第三十頁，共

12、54頁。顯示(xinsh)的是一個(gè)234bp 長的DNA 片段的解鏈區(qū)域，橫坐標(biāo)是該DNA 片段的序列，依次從第一個(gè)堿基到第234 個(gè)堿基；縱坐標(biāo)是解鏈溫度。該DNA 片段共有3 個(gè)解鏈區(qū)域。MD1 是解鏈溫度最低的一個(gè)解鏈區(qū)域，MD3 是溫度最高的一個(gè)解鏈區(qū)域。第30頁/共53頁第三十一頁，共54頁。當(dāng)它們(t men)進(jìn)行DGGE時(shí)，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時(shí)DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。一旦DNA 片段遷移到一定(ydng)位置，其變性劑濃度使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，部分解鏈的DNA 片段在膠中的遷移速率會急

13、劇降低。因此，不同的DNA 片段會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。第31頁/共53頁第三十二頁，共54頁。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般(ybn)30-50 個(gè)堿基對）可以解決這個(gè)問題。含有GC 夾子的DNA 片段解鏈溫度(wnd)很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC 夾子后，DNA 片段中每個(gè)堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。第32頁/共53頁第三十三頁，共54頁。第33頁/共53頁第三十四頁，共54頁。通常根據(jù)16S rRNA 基因(jyn)中比較保守的堿基序列設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物

14、的5-端含有一段GC 夾子，用來擴(kuò)增微生物群落基因(jyn)組總DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物用于DGGE/TGGE 分析。由于DGGE/TGGE一般只能分析(fnx)500 bp 以下的DNA片斷，所以一般選擇擴(kuò)增16S rRNA基因的V3區(qū)或V6-V8區(qū)。第34頁/共53頁第三十五頁，共54頁。40%60%DenaturantCABCBADenaturing Gradient Gel ElectrophoresisPCR11f1512r1392r968fgc16S rDNA第35頁/共53頁第三十六頁，共54頁。第36頁/共53頁第三十七頁，共54頁。熒光熒光(ynggung)原位雜交（原位雜交（Flu

15、orescence In Situ Hybridization ） 第37頁/共53頁第三十八頁，共54頁。通過FISH技術(shù)可以解決在固定群落中微生物的分布問題。原始的生物膜和絮狀污泥用多聚甲醛固定在凝膠包被(bo bi)的玻璃上，固定并已穿孔的細(xì)胞與熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，DNA探針就會與細(xì)胞中互補(bǔ)的DNA或RNA雜交；然后在熒光顯微鏡下就可以觀察到發(fā)光的細(xì)胞，偶聯(lián)的FISH在激光共聚焦顯微鏡下可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞在微生物菌落三維結(jié)構(gòu)中的定位。第38頁/共53頁第三十九頁，共54頁。常用熒光(ynggung)原位雜交探針一覽表探針名稱系統(tǒng)類群序列SequenceTm（C）Hyb/Wash T

16、emp（C）salt（M NaCl）UNIVuniversalacgggcggtgtgtrcgwattaccgcggckgctg626437 (0.5)ARCHArchaeagtgctcccccgccaattcct7343 (0.5)BACTBacteria(EUB338)gctgcctcccgtaggagt6437 (0.5)EUKEucaryagggcatcacagacctgtagaaagggcaggga585437 (0.5)HiGCHigh G+C Gram+ccygatatctgcgca4537 (0.5)LoGCLow G+C Gram+tgtagcccargtcata5537 (

17、0.5)CFBFlavobacteriatcagtrccagtgtggggg5837 (0.5)AlphaAlpha-proteoscgragttagccggggc5737 (0.5)BetaBeta-proteostcactgctacacgyg5637 (0.5)GammaGamma-proteoscttttgcarcccact4137 (0.5)DeltaDelta-proteosgcttkcawgmagagg4737 (0.5)SRB2Sulfate-reducerscgygcgccrctytact5737 (0.5)PseudoPseudomonas sp.ccttcctcccaact

18、t5237 (0.5)GSulfGreen Sulfurcttttargggatttcctctg5437 (0.5)EuryEuryarchaeotacttgcccrgcccttgacctaccgtngyccr585242(0.5)CrenCrenarchaeotaccagrcttgccccccgct7242 (0.5)第39頁/共53頁第四十頁，共54頁。FISH常用(chn yn)熒光素第40頁/共53頁第四十一頁，共54頁。第41頁/共53頁第四十二頁，共54頁。 universal gamma probe universal specific probe 1 specific prob

19、e 2第42頁/共53頁第四十三頁，共54頁。分析復(fù)雜環(huán)境微生物群落分析復(fù)雜環(huán)境微生物群落(qnlu)結(jié)構(gòu)的方法的最近進(jìn)展：結(jié)構(gòu)的方法的最近進(jìn)展：第43頁/共53頁第四十四頁，共54頁。未培養(yǎng)微生物資源未培養(yǎng)微生物資源(zyun)的開發(fā)：的開發(fā)：任何微生物培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)基都不能完全再現(xiàn)全部微生物的自然生存環(huán)境，使用免培養(yǎng)技術(shù)和基因組技術(shù)，直接分離土壤系統(tǒng)中未培養(yǎng)微生物DNA樣品并建立相應(yīng)的生態(tài)基因組庫，通過高通量篩選技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的新的重要功能基因的研究，鑒定參與污染物降解與轉(zhuǎn)化、各種抗酸、抗鹽、抗?jié)?、抗?kng hn)及抗（耐）重金屬毒害等抗逆特殊功能基因。我國科學(xué)加已經(jīng)建立了深海樣品、云

20、南騰沖熱泉，青海藏牦牛瘤胃、造紙廠廢水排污口和傳統(tǒng)堆肥未培養(yǎng)微生物的生態(tài)基因文庫，獲得了一批具有特殊性質(zhì)和應(yīng)用前景的淀粉酶、蛋白酶和脂酶編碼基因。第44頁/共53頁第四十五頁，共54頁。生生 物物 圈圈種類種類(zhngli)豐豐富多樣的微生富多樣的微生物物分分離離(fnl)培培養(yǎng)養(yǎng)大規(guī)模發(fā)大規(guī)模發(fā)酵酵(f jio)培養(yǎng)培養(yǎng)宏基因組宏基因組篩選篩選獲得產(chǎn)物獲得產(chǎn)物通過構(gòu)建宏基因組表達(dá)文庫，通通過構(gòu)建宏基因組表達(dá)文庫，通過基于序列或酶活力篩選文庫獲過基于序列或酶活力篩選文庫獲得目的基因。得目的基因。缺陷：缺陷：超高通量的篩選或者需具有選超高通量的篩選或者需具有選擇標(biāo)記的分析方法。擇標(biāo)記的分析方法

21、。進(jìn)展：進(jìn)展：底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選。構(gòu)。構(gòu)建建 GFP表達(dá)載體，通過表達(dá)載體，通過 fluorescence-activated cell sorting (FACS)來篩庫來篩庫. 宏基因組宏基因組DNA克隆到克隆到gfp上游，首先排除組上游，首先排除組成表達(dá)的克隆成表達(dá)的克隆.不發(fā)熒光的克隆在底物上生長，來不發(fā)熒光的克隆在底物上生長，來篩選誘導(dǎo)表達(dá)篩選誘導(dǎo)表達(dá)gfp的克隆，這種篩的克隆，這種篩選方法利用代謝基因被底物誘導(dǎo)選方法利用代謝基因被底物誘導(dǎo)表達(dá)的特性表達(dá)的特性。第45頁/共53頁第四十六頁，共54頁。針對未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)技術(shù)針對未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)技術(shù)(jsh)

22、研究研究微生物不可培養(yǎng)的原因微生物不可培養(yǎng)的原因 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件(tiojin)(tiojin) 營養(yǎng)限制營養(yǎng)限制 失去生態(tài)位失去生態(tài)位 第46頁/共53頁第四十七頁，共54頁。模擬原位生態(tài)條件的培養(yǎng)模擬原位生態(tài)條件的培養(yǎng)(piyng)技術(shù)技術(shù)主體為一個(gè)墊圈，兩側(cè)主體為一個(gè)墊圈，兩側(cè)(lin c)用的濾膜封住，允許環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)通過，但不允許細(xì)胞通過。在魚缸底部倒上一層海底沉積物，其上放置擴(kuò)散室，加入天然海水至剛好漫過擴(kuò)散室，使海水不斷循環(huán)。用的濾膜封住，允許環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)通過，但不允許細(xì)胞通過。在魚缸底部倒上一層海底沉積物，其上放置擴(kuò)散室，加入天然海水至剛好漫過擴(kuò)散室，使海水不斷循環(huán)。

23、Isolating “Uncultivable” Microorganisms in Pure Culture in a Simulated Natural Environment,T. Kaeberlein, K. Lewis,* S. S. Epstein*, SCIENCE VOL 296 10 MAY 2002第47頁/共53頁第四十八頁，共54頁。Science 2002第48頁/共53頁第四十九頁，共54頁。土壤土壤(trng)宏基因組（宏基因組（Metagenome）計(jì)劃）計(jì)劃 把所有緊密聯(lián)系在一起的土壤-生物的團(tuán)聚體理解為是一個(gè)“土壤細(xì)胞”，把這一特定的土壤功能單位內(nèi)全部生物遺傳物質(zhì)總和看成(kn chn)是一個(gè)基因組，即土壤宏基因組, 通過宏基因組測序策略（metagenomics sequencing strategy）隨機(jī)鳥槍法測序（random shotgun sequencing）重建全基因組，通過整合生物信息學(xué)理論與方法（JAZZ全基因組鳥槍法匯編程序），從基因水平上重建土壤功能單位的能量流、代謝流和信息流，描繪土壤功能團(tuán)的藍(lán)圖，重新理解土壤的真正功能、微生物之間的共生、