免疫血清的制備

1、免疫血清的制備免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。高效價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑（如用于制備免疫標(biāo)記抗體等），也可供特異性免疫治療用。免疫血 清的效價(jià)高低取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫 原性。如以免疫原性強(qiáng)的抗原刺激高應(yīng)答性的機(jī)體，常可獲 得高效價(jià)的免疫血清。免疫血清的制備是常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。高效價(jià)、高 特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑（如用于制備免疫標(biāo)記抗體等），也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效 價(jià)高低取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如 以免疫原性強(qiáng)的抗原刺激高應(yīng)答性的機(jī)體，常可獲得高效價(jià) 的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時(shí)，則

2、需同時(shí)加 用佐劑以增強(qiáng)抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決 于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清， 必須予先純化抗原。此外，抗原的劑雖、免疫途徑及注射抗 原的時(shí)間間隔等，也是影響免疫血清效價(jià)的重要因素應(yīng)予重 視。一、原理具有免疫原性的抗原可刺激機(jī)體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的 B細(xì)胞克隆所識(shí)別，因此由某一抗原刺 激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同決 定簇的抗體混合物（即多克隆抗體）。另外，抗體的產(chǎn)生具有 回憶應(yīng)答的規(guī)律性，抗 m現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射 后的抗體應(yīng)答特點(diǎn)截然不同。是由于記憶性

3、B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致。二、免疫方法根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。1. 用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘 酒消毒皮膚；2. 第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑（FCA） 乳化的抗原（人IgG）下稱FCA-IgG）液1ml,每側(cè)腳掌皮下各 注入0.5ml。3. 第二次免疫：間隔 10-14天后，于兩側(cè) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG,每淋巴結(jié)注 0.1ml ,其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時(shí)，直接注入兩側(cè)窩及鼠蹊部皮下。4. 間隔7-10天后，從耳靜脈采血 0.51.0ml ,分離血清，以雙相瓊

4、脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)（即試血）。效價(jià)至少應(yīng)達(dá)到1 ： 16以上時(shí)才能放血。5. 若效價(jià)未達(dá)到要求，可用不加佐劑的抗原液（人IgG） 耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、 0.5ml。間隔1周再試血。如效價(jià)達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另 外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐劑 （FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡(jiǎn)稱FIA-IgG）再免疫1-2次。注射部位、劑雖 和間隔均同第2次，再試血測(cè)抗體效價(jià)，如效價(jià)達(dá)到要求立 即放血。三、放血（一）心臟采用血法1. 家兔仰面，四肢縛于動(dòng)物固定架上（或由助手抓住四肢固定）；2. 剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；3. 用左姆指摸到胸骨劍突

5、處，食指及中指放在右胸處 輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左 拇指觸摸心臟搏動(dòng)最強(qiáng)的部位；4. 用50ml注射器（連接16號(hào)針頭），傾針45角度， 對(duì)準(zhǔn)心搏最強(qiáng)處刺入心臟抽血致死；5. 將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后 分離血清。（二）頸動(dòng)脈放血法1. 家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛 及消毒皮膚；2. 沿頸部中線切開皮膚約 10cm,分離皮下組織，直至 暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌;3. 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴 露出頸總動(dòng)脈后使之游離；4. 于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心 端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾住

6、；5. 用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口， 插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上， 以防放血管滑脫；6. 松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一 只家兔可放血 80100ml o四、分離血清1、將三角燒瓶的血置 37 C溫箱1小時(shí)2、再置4C冰箱內(nèi)34小時(shí)。3、待血液凝固血塊收縮后，用毛細(xì)滴管吸取血清。4、于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑（0.01 % 硫柳汞或0.02 %疊氮鈉，最終濃度）5、分裝后置4 C冰箱中保存?zhèn)溆?。五、結(jié)果鑒定以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定所獲免疫血清的抗體效價(jià)，并 用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)雖，應(yīng)產(chǎn)生單一的 沉淀孤線。鑒

7、定方法的具體步驟參見有關(guān)部分。六、材料(0 動(dòng)物：健康成年家兔，雄性,體重23公斤。（二一）器材：男刀、鍥子、注射器（2ml、50ml）附針頭（9號(hào)、6 號(hào)）、稱H瓶（10ml）、H筒、動(dòng)物固定架、滅菌二角燒瓶（200ml）、手術(shù)器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。（三）試劑1. 滅菌生理鹽水；2. 純化人 IgG（10mg/ ml）;3. 消毒酒精及碘酒；4. 羊毛脂；5. 石蠟油；6. 活卡價(jià)苗（BCG）（75mg/ ml）;7. 弗氏不完全佐劑（FIA）制備：稱羊毛脂10克，逐滴加入優(yōu)質(zhì)石蠟油 40ml，邊滴邊研磨，分裝于疫苗瓶中（每瓶10ml）,高壓滅菌（8磅20分鐘）后保存?zhèn)溆谩?/p>

8、8.弗氏完全佐劑乳化抗原 （FCA-IgG）的制備將 FIA 予溫（60 C 30分鐘），吸取 3ml于研缽中，逐滴加入活 BCG（75m ml）0.5ml 及純化人 IgG2.5ml（2.4mg / ml）抗_滴 入邊研磨直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴于冷水面上不散開為合格。七、注意事項(xiàng)1. 免疫用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體反應(yīng)性個(gè)體差異性較大，因 此免疫時(shí)至少應(yīng)選用兩只以上動(dòng)物。另外，不能使用妊娠動(dòng)物。2. 免疫用的抗原必須經(jīng) FCA或FIA充分乳化后才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的 方法較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。采用 H-81微型振蕩混合器法或三腔管 研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑

9、按比例混合后，置于混 合器上使之劇烈振蕩(頻率2900轉(zhuǎn)/分，振幅6mm)后者是 將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后，吸入注射器內(nèi)再將 注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約1小時(shí)即可使抗原充分乳化。3. 佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得高效價(jià)的免疫血清，但若抗原不純時(shí)，可使抗原中極微雖的污 染物(0.005mgN)產(chǎn)生抗體，以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影 響。另外，有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系對(duì)BCGG±敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當(dāng)再次注射完全佐劑時(shí)，可以引起變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此，第二次免疫注射時(shí)應(yīng)減少佐劑中BCG勺含雖或改用不完全佐劑，以減少和防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。4. 抗原的劑H決定于抗原的種類。對(duì)免疫原性強(qiáng)的抗 原劑雖應(yīng)相別較少，免疫原性弱的抗原劑雖可相對(duì)較多?？?原的用雖一般以體重計(jì)算。在使用佐劑的情況下，一次注入 的總劑雖以0.5mg/kg體重為宜。如不加佐劑時(shí)劑雖