皮質(zhì)骨I型膠原的提取及膠原明膠支架材料的制備

1、皮質(zhì)骨I型膠原的提取及膠原-明膠支架材料的制備【摘要】 探索一種較理想的皮質(zhì)骨I型膠原的提取方法并制備膠原-明膠支架材料。方法以牛皮質(zhì)骨為原料，經(jīng)低溫液氮粉碎、梯度脫水、脫脂、脫鈣處理成為脫鈣骨基質(zhì)粉。通過酶溶解法處理脫鈣骨基質(zhì)粉，經(jīng)溶解、離心、透析、凍干等步驟獲得皮質(zhì)骨膠原，SDSPAGE電泳、氨基酸分析等方法鑒定其特征；再以膠原、明膠通過冷凍干燥技術(shù)制備神經(jīng)支架材料，掃描電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。結(jié)果所得膠原經(jīng)SDSPAGE電泳、氨基酸分析等方法鑒定符合I型膠原特征；制備的支架材料外觀呈圓柱狀，內(nèi)部為孔徑均勻平行排列的微管結(jié)構(gòu)，具有仿生效果。結(jié)論皮質(zhì)骨中能夠獲得純度較高的I型膠原，可用于膠原材料

2、的制作。 【關(guān)鍵詞】 組織工程 膠原 提取 神經(jīng)支架 Abstract：ObjectiveTo develop an ideal method for extracting type I collagen from cortical bone and to prepare a collagengelatin scaffold.MethodThe cortical bone was disintegrated into bone matrix powder in a high speed mill and was subsequently dehydrated in alcohol,decalc

3、ificated in hydrochloric acid and defatted in chloroform:methanol (1:1,v/v).The osscins were extracted using improved pepsin digestion method after the bone matrix powder was dissolved,centrifuged,dialyzed and lyophilized. Type I collagen was then characterized by SDSPAGE and aminoacid composition a

4、nalysis. The biomaterial was made of type I collagen and gelatin using freezedrying method,and the alignment regularities of microscopic channels and their course directions were observed under the scanning electronic microscope.The size of the micropores and the factor of porosity were also measure

5、d. Result The collagen extracted was confirmed to be type I collagen by SDSPAGE and aminoacid composition analysis. All the scaffolds looked like circular cylinder,the microscopic channels were arranged in parallel manners,and the pore sizes of the channels were uniform.ConclusionOssein extracted fr

6、om cortical bone is a real type I collagen that can be applied in the construction of collagen products. Key words：tissue engineering; collagen; extraction; nerve scaffold 周圍神經(jīng)缺損后的修復(fù)再生和功能恢復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。由于周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能上的特殊性，損傷后大多數(shù)情況下無法直接對(duì)拉吻合，自體神經(jīng)移植又有諸多限制，因此尋找一種神經(jīng)替代物來修復(fù)缺損是十分必要的。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，用于神經(jīng)修復(fù)研究

7、的材料品種越來越多。目前型膠原蛋白制品為組織工程修復(fù)神經(jīng)研究中應(yīng)用較多的生物材料之一1。型膠原通常來自牛腱、鼠尾或皮膚，由于上述組織中含有大量其它種類的膠原和非膠原成分，提取及純化工藝復(fù)雜。骨中型膠原含量豐富，占骨基質(zhì)中有機(jī)成分的95以上，本實(shí)驗(yàn)將傳統(tǒng)的酶提取法加以改進(jìn)，提取牛皮質(zhì)骨中I型膠原并制備神經(jīng)支架材料。 1 材料與方法 1.1 骨基質(zhì)粉的制備 取新鮮牛長(zhǎng)骨，去除軟組織、骨膜、骨端松質(zhì)骨及骨髓，然后將皮質(zhì)骨劈成骨塊，乙醇 (60、70、80、90)梯度脫水，液氮冷凍后放入高速組織粉碎機(jī)中，粉碎為直徑0.62 mm骨粉，持續(xù)攪拌下加入甲醇：氯仿(11，vv)脫脂48 h，每24 h換脫脂

8、液1次;0.6 molL鹽酸脫鈣84 h，分別于第12、36、60 h換脫鈣液，脫鈣結(jié)束后去離子水洗滌3次備用。 1.2 膠原的提取 將50 g牛皮質(zhì)骨基質(zhì)粉浸在500 ml 0.05 molL冰醋酸和500 mg胃蛋白酶混合溶液中，持續(xù)攪拌96 h。待混合物變?yōu)闊o色、透明、粘稠液體后高速低溫離心20 min(10 000 rmin)，以去除未溶解雜質(zhì)。其上清即為液態(tài)粗制膠原。在上清中緩慢加入NaCl，攪拌過夜，離心20 min(15 000 rmin)，去上清，沉淀物加入0.5 molL冰醋酸溶解，離心20 min(15 000 rmin)，取上清加入5 molL NaOH調(diào)pH至7.3，緩

9、慢加入NaCl，攪拌過夜，離心20 min(15 000 r/min)，去上清，沉淀物加入0.5 molL醋酸中透析溶解，離心10 min(15 000 r/min)，去沉淀，上清裝入透析袋中持續(xù)透析72 h，每4 h更換透析液1次。最終收獲無色透明粘性液體，濃縮凍干。以上液體及操作在47進(jìn)行。 1.3 支架材料的制備 稱取樣品150 mg、明膠(Sigma公司)75 mg溶于0.05 molL冰醋酸溶液，4條件下攪拌90 min(18 000 rmin)，負(fù)壓抽真空后于4冰箱中過夜，充分混合成凝膠狀懸濁液后將其注入長(zhǎng)10 cm、內(nèi)徑3 mm的硅膠管中，密封兩端，順軸向以自制微型調(diào)速儀以2&#

10、215;10-5 ms的速度浸入冷凝劑中，將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預(yù)冷的鋁盤中，于-40、100 mTorr條件中凍干48 h，制得干燥成形的膠原蛋白支架材料2。材料用戊二醛交聯(lián)，60Co消毒密封備用3。 1.4 膠原的鑒定 1.4.1 取樣品2 g溶于420l加樣緩沖液(1 molL TrisHCl緩沖液，10SDS，2巰基乙醇，50甘油，微量溴酚藍(lán))過夜，100，5 min，離心10 min(12 000 r/min)，取上清20 l加樣，進(jìn)行SDSPAGE垂直平板電泳，濃縮膠5，分離膠8，電極緩沖液SDSTris甘氨酸系統(tǒng)，濃縮膠電壓40 V，分離膠電壓80 V，0.25考馬斯亮藍(lán)R2

11、50染色，以牛腱I型膠原標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)作為對(duì)照。 1.4.2 將凍干樣品水解后，應(yīng)用Beckman 121MB 型氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸分析。 1.4.3 用U2001紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定膠原最大光吸收波長(zhǎng)。 1.5 支架材料內(nèi)部掃描電鏡觀察 以掃描電鏡觀察上述制備的膠原蛋白支架材料橫截面和縱切面并測(cè)量材料內(nèi)部微孔的直徑。 2 結(jié) 果 2.1 選擇適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)換脫鈣液，持續(xù)脫鈣84 h，可將骨粉中的鈣離子含量降到較低水平(圖1)。 2.2 膠原樣品鑒定結(jié)果 2.2.1 提取的樣品凍干后呈蓬松的白色海綿狀，具有吸潮性（圖2）。 2.2.2 SDSPAGE電泳結(jié)果顯示，提取的膠原樣品

12、與型膠原標(biāo)準(zhǔn)品相同（圖3）。 2.2.3 最大光吸收波長(zhǎng)檢驗(yàn)結(jié)果 樣品在230 nm波長(zhǎng)處顯示較強(qiáng)的光吸收，符合膠原特性。 2.2.4 樣品氨基酸分析結(jié)果 甘氨酸占氨基酸總量的31.12%，羥脯氨酸占氨基酸總量的9.12%，脯氨酸占氨基酸總量的12.85%，羥脯氨酸與脯氨酸之比約0.71，氨基酸構(gòu)成比符合型膠原特性（表1）。表1 皮質(zhì)骨磁針原氨基酸組成 2.3 掃描電鏡觀察結(jié)果 支架材料外觀為表面封閉的圓柱狀結(jié)構(gòu)，電鏡下見縱切面為軸向平行排列的微管結(jié)構(gòu)，橫切面上微管結(jié)構(gòu)呈內(nèi)徑均一的蜂巢狀分布，孔徑在20100 m，接近于坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)（圖4、5）。 3 討 論 近年來，應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建種子細(xì)

13、胞和具有良好生物相容性的支架材料復(fù)合體人工神經(jīng)修復(fù)外周神經(jīng)損傷成為研究的重點(diǎn)。人工神經(jīng)研究的關(guān)鍵之一在于如何選擇合適的支架材料，以便復(fù)合種子細(xì)胞、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子從而更好的發(fā)揮促神經(jīng)再生作用。目前，以天然的細(xì)胞外基質(zhì)為原料制備支架材料成了研究的新方向。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，廣泛分布于骨、肌腱、韌帶、皮膚、軟骨等結(jié)締組織中，約占動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的1413，在細(xì)胞的分化、運(yùn)動(dòng)化趨向、結(jié)締組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)具有生物可降解性、低抗原性、低毒性、能誘導(dǎo)細(xì)胞再生及易獲得性等諸多優(yōu)點(diǎn)，可參與組織愈合過程，在軟骨細(xì)胞再生誘導(dǎo)4、角膜移植5、人工皮膚制備6等方面得到廣泛應(yīng)用，應(yīng)用在周圍神經(jīng)損傷

14、修復(fù)中亦能刺激改善神經(jīng)的再生7。 圖1 鈣離子濃度變化 圖2 凍干樣品 圖3 樣品電泳圖譜 圖4 掃描電鏡下觀察支架材料橫切面（×400） 圖5 掃描電鏡下觀察支架材料縱切面（×200） 以往膠原的提取多集中在相對(duì)易于處理的牛腱、豬皮和鼠尾腱。由于膠原是一個(gè)大的蛋白家族，從上述組織中提取時(shí)分型、純化難度較大，程序復(fù)雜，而且耗時(shí)較長(zhǎng)，易導(dǎo)致膠原變性。骨膠原的提取純化報(bào)道較少，而骨中有機(jī)質(zhì)90以上為膠原，主要為I型膠原，有望作為制備I型膠原的重要來源。作者將傳統(tǒng)的酶溶解法加以改進(jìn)應(yīng)用于骨膠原的提取，在骨粉顆粒直徑、脫脂脫鈣時(shí)間、酶促溶解、抽提次數(shù)等方面加以細(xì)化，省去分型、純化等

15、冗長(zhǎng)程序，耗時(shí)較短，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。I型膠原的氨基酸組成中，甘氨酸約占氨基酸總量的13;含有羥賴氨酸和羥脯氨酸，一般蛋白質(zhì)中則不存在羥賴氨酸，羥脯氨酸也很少見;羥脯氨酸與脯氨酸之比約為0.70.8。本實(shí)驗(yàn)樣品膠原氨基酸分析符合I型膠原的組成特征，最大光吸收波長(zhǎng)在230 nm附近，電泳分析其區(qū)帶與I型膠原標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)帶相同。結(jié)果顯示，作者通過實(shí)驗(yàn)獲得了純度較高的I型膠原。作者以實(shí)驗(yàn)獲得的I型膠原和明膠為主要原料，構(gòu)建了具有微管排列結(jié)構(gòu)的支架材料，其內(nèi)徑在20100m，三維結(jié)構(gòu)上接近于坐骨神經(jīng)，具有一定的仿生效果。實(shí)驗(yàn)表明8，將具有促進(jìn)軸突再生功能的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)種植在支架材料并共培養(yǎng)后，細(xì)胞

16、黏附在支架材料內(nèi)部，生長(zhǎng)狀況良好，顯示支架材料具有良好的生物相容性。綜上所述，作者制備的皮質(zhì)骨膠原，具有較高的純度，并可用于膠原蛋白材料的制備，具有較好的實(shí)用價(jià)值。參考文獻(xiàn)：【參考文獻(xiàn)】 1 蔣挺大膠原與膠原蛋白M北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2006,242-2452 Etoh S,Takakuda K,Kawabata K,et alEvaluation of crosslinking procedures of collagen tubes used in peripheral nerve repairJBiomaterials,2002,23：4475-44813 梁 偉，羅卓荊，王樹森，等修

17、復(fù)神經(jīng)缺損的組織工程支架材料的研制及其生物相容性研究J中華創(chuàng)傷骨科雜志,2004,9：1037-10414 Wahl DA,Sachlos E,Liu C,et alControlling the processing of collagenhydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineeringJJ Mater Sci Mater Med,2007，2：201-2095 Liu Y, Gan L,Carlsson DJ,et al.A simple,crosslinked collagen tissue substitute for corneal implantationJ.Invest Ophthalmol Vis Sci,2006,5: 1869-1875.6 Ismarul IN,Ishak Y, Ismail Z,et al. Characterization of collagen/chitosan films for skin regener