缺氧調(diào)控報(bào)告載體的構(gòu)建與鑒定

1、缺氧調(diào)控報(bào)告載體的構(gòu)建與鑒定 作者：楊潔，李占亭，杜德偉，柴青煥，王麗，張惠中，孫脊峰【關(guān)鍵詞】 熒光素酶 Construction and identification of hypoxia regulatory reporter vectors【Abstract】 AIM: To construct the firefly luciferase reporter gene vectors regulated by hypoxia response promoters. METHODS: The oligonucleotides of hypoxia response element (HR

2、E) and a mutation control were synthesized and cloned into pCIneo vectors to constrct HRE/CMV recombinant vectors. Then HRE/CMV promoters amplified by PCR were subcloned into pGL3Basic vectors. RESULTS: The integrity reporter vectors were verified by restriction enzyme digestion. Also, the sequences

3、 of the vectors were detected and aligned to the expected sequences. CONCLUSION: Luciferase reporter vectors regulated by HRE/CMV promoters were successfully constructed, which makes it possible to further investigate their potency of hypoxia regulation.【Keywords】 transcription；regulation；hypoxia; r

4、esponse elements；luciferase；reporter gene【摘要】 目的：構(gòu)建能用來檢測(cè)缺氧應(yīng)答啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體. 方法：合成缺氧應(yīng)答元件(HRE)的寡核苷酸序列及其突變對(duì)照，克隆入pCIneo，構(gòu)建HRE/CMV重組載體. 然后采用PCR方法將HRE/CMV啟動(dòng)子定向亞克隆入pGL3Basic. 結(jié)果：酶切和測(cè)序鑒定分析，所克隆的基因產(chǎn)物酶切結(jié)果與預(yù)期值一致，序列無堿基的突變. 結(jié)論：成功構(gòu)建了缺氧應(yīng)答啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體，為進(jìn)一步研究其缺氧調(diào)控作用提供了條件.【關(guān)鍵詞】 轉(zhuǎn)錄；調(diào)控；缺氧;反應(yīng)元件；熒光素酶；報(bào)告基因0引言目前已開發(fā)出多

5、種報(bào)告載體用于研究啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的調(diào)控活性1-3，如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報(bào)告載體，半乳糖苷酶報(bào)告載體，葡萄糖醛酸酶報(bào)告載體，堿性磷酸酶報(bào)告載體，綠色熒光蛋白報(bào)告載體以及熒光素酶報(bào)告載體. 其中熒光素酶報(bào)告載體以其檢測(cè)迅速、敏感和重現(xiàn)性好，被廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究4. 在基因調(diào)控機(jī)制研究中，應(yīng)用報(bào)告載體對(duì)可能調(diào)控哺乳動(dòng)物基因表達(dá)的基因元件進(jìn)行定量分析是極為重要和必要的. 缺氧應(yīng)答元件(hypoxia response element, HRE)是對(duì)缺氧可做出應(yīng)激反應(yīng)的缺氧反應(yīng)基因內(nèi)一段小于100 bp的單拷貝或多拷貝的順式作用元件，能夠與轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia i

6、nducible factor 1, HIF1)結(jié)合，啟動(dòng)缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)5-6. 本文將各種不同缺氧應(yīng)答基因的HRE與CMV啟動(dòng)子組合成缺氧應(yīng)答啟動(dòng)子，構(gòu)建其熒光素酶報(bào)告載體，快速對(duì)該遺傳調(diào)控元件進(jìn)行功能性分析.1材料和方法1.1材料Taq DNA聚合酶及Kpn，Hind限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司. 質(zhì)粒小量制備與純化試劑盒、PCR試劑購(gòu)自天為時(shí)代公司. Bgl，Sgf，IPpo限制性內(nèi)切酶和pCIneo真核表達(dá)載體、pGL3Basic報(bào)告基因載體、JM109菌種由Promega公司提供. HREs的正向和反向單鏈由博雅公司合成（兩端帶有限制性內(nèi)切酶的粘端切口）

7、. 引物由奧科公司合成. 測(cè)序由基康公司完成. 其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1HRE退火合成的HRE單鏈用去離子滅菌水稀釋成3 g/L，退火反應(yīng)體系：正向單鏈2 L，反向單鏈2 L，1×退火液將總體積補(bǔ)至50 L（退火液的配方：醋酸鉀0.98 g，HEPES 0.72 g，KOH 0.18 g，醋酸鎂0.043 g，去離子水100 mL，溶解后高壓蒸氣消毒，備用）. 退火反應(yīng)條件：95 5 min變性后，70 10 min，關(guān)掉水浴鍋，緩慢降至4，過夜.1.2.2HRE/CMV重組載體構(gòu)建帶有Bgl和Sgf切口的HRE正向和反向單鏈退火成雙鏈后定向克隆入經(jīng)相應(yīng)酶切去

8、除CMV增強(qiáng)子的pCIneo載體，構(gòu)建HRE/CMV重組載體，轉(zhuǎn)化至JM109大腸桿菌，挑選單克隆，提取重組質(zhì)粒后對(duì)其行酶切鑒定，對(duì)符合預(yù)期值的克隆進(jìn)行測(cè)序.1.2.3HRE/CMV報(bào)告載體的構(gòu)建以測(cè)序正確的HRE/CMV重組載體為模板，設(shè)計(jì)并合成含Kpn，Hind限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物，采用PCR方法克隆HRE/CMV調(diào)控序列. PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix，12.5 L；Primer1，1 L； Primer2，1 L；質(zhì)粒模板，1 L；總體積，25 L. PCR反應(yīng)條件：95 5 min變性后，95，30 s，68，45 s，72，45 s，30個(gè)循環(huán)

9、. PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳凝膠回收后，進(jìn)行Kpn和Hind雙酶切，定向克隆入經(jīng)相應(yīng)酶切的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3Basic，轉(zhuǎn)化至JM109大腸桿菌，挑選單克隆，提取重組質(zhì)粒后對(duì)其行酶切鑒定，對(duì)符合預(yù)期值的克隆進(jìn)行測(cè)序.2結(jié)果2.1HRE/CMV重組載體的鑒定合成的HRE正向和反向單鏈退火成雙鏈后，與酶切后的pCIneo載體進(jìn)行定向連接. 利用酶切對(duì)載體進(jìn)行鑒定，選擇Bgl和IPpo兩個(gè)酶切位點(diǎn)，可得到約280 bp的片段. 酶切后電泳如圖1所示，可見到與預(yù)期值相符的片段. 測(cè)序結(jié)果也與設(shè)計(jì)序列完全相同.M: DL2000 marker; 16: HRE/CMV(ENO，ENOm，VEGF

10、，EPO，hPGK，mPGK) （Bgl+IPpo）.圖1pCIneoHRE/CMV的酶切鑒定圖（略）2.2HRE/CMV報(bào)告基因載體的鑒定以HRE/CMV重組載體為模板進(jìn)行PCR，預(yù)期可獲得約150 bp的HRE/CMV轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件. 如圖2所示，可見與預(yù)期大小相符的片段. 將回收的特異片段經(jīng)Kpn和Hind雙酶切后克隆入pGL3Basic，轉(zhuǎn)化后提取重組質(zhì)粒酶切鑒定，如圖3所示，可見與預(yù)期大小相符的片段. 測(cè)序結(jié)果完全正確.3討論作為報(bào)告基因，熒光素酶是一類能催化底物并發(fā)射熒光的酶家族. 包括細(xì)菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶以及近年發(fā)現(xiàn)的海洋腔腸熒光素酶. 其中螢火蟲熒光素酶克隆于北美洲螢火蟲

11、基因，它編碼一條6.2×104的多肽鏈，其活性不需轉(zhuǎn)錄后修飾，無二硫鍵，不需要輔助因子和結(jié)合金屬，幾乎在任何宿主細(xì)胞中表達(dá). 它能催化甲蟲熒光素的氧化性羧化作用，發(fā)射出光子，可由光度計(jì)捕獲并定量. 該酶半衰期很短，對(duì)于基因元件的誘導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)行瞬間分析效果很好. 由于大多數(shù)生物缺少內(nèi)源熒光，所以幾乎無背景干擾. 鑒于此，螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于不同啟動(dòng)子下外源基因表達(dá)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的研究. 報(bào)告基因分析系統(tǒng)一般需要2個(gè)不同的報(bào)告載體同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，一個(gè)標(biāo)化轉(zhuǎn)染效率，作為內(nèi)參照；另一個(gè)測(cè)定啟動(dòng)子調(diào)控活性. 螢火蟲熒光素酶和海洋腔腸熒光素酶這2種報(bào)告載體具有兼容的化學(xué)特性、操

12、作條件、速度、靈敏度、線性范圍和儀器需要，使用標(biāo)準(zhǔn)光度計(jì)即可迅速完成測(cè)試.M：DL2000 marker; 16: HRE/CMV（ENO，ENOm，VEGF，EPO，hPGK，mPGK）.圖2HRE/CMV PCR產(chǎn)物（略）M: DL2000 marker; 16: HRE/CMV(ENO，ENOm，VEGF，EPO，hPGK，mPGK) （Kpn+Hind）.圖3pGL3BasicHRE/CMV的酶切鑒定圖（略）將HRE調(diào)控序列與CMV啟動(dòng)子組合后與報(bào)告基因連接，構(gòu)建通過HRE調(diào)控報(bào)告基因表達(dá)的質(zhì)粒. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過細(xì)胞自身DNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，作用于基因調(diào)控序列. 如果轉(zhuǎn)錄因子對(duì)調(diào)控序

13、列存在反式調(diào)控作用，此調(diào)控序列就會(huì)引發(fā)報(bào)告基因的表達(dá). 由于報(bào)告基因的表達(dá)量是可檢測(cè)并能進(jìn)行定量分析，因而即可反映HRE調(diào)控序列對(duì)基因誘導(dǎo)調(diào)控的作用. 本研究設(shè)計(jì)組合了5個(gè)缺氧應(yīng)答啟動(dòng)子及1個(gè)突變對(duì)照，并克隆于pGL3Basic螢火蟲熒光素酶基因的上游，整合的pGL3BasicHRE/CMV載體經(jīng)限制性酶切鑒定，載體測(cè)序結(jié)果也與預(yù)期完全相同. 這就為進(jìn)一步研究HRE/CMV遺傳調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用提供了資源和條件.【參考文獻(xiàn)】1 Phippard D, Manning AM. Screening for inhibitors of transcription factors using lu

14、ciferase reporter gene expression in transfected cells J. Methods Mol Biol, 2003, 225:19-23.2 Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression J. Science, 1994, 263: 802-805.3 Basu C, Kausch AP, Chandlee JM. Use of betaglucuronidase reporter gene for gene expression analysis in turfgrasses J. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 320(1):7-10.4 Bronstein I, Martin CS, Fortin JJ, et al. Chemiluminescence: Sensitive detection technology for reporter gene assays J. Clin Chem, 1996, 42: 1542-154