免疫學(xué)質(zhì)量控制流程

1、免疫學(xué)質(zhì)量控制流程目的】保證 ELISA 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可 *, 充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)?！驹?SOP變動(dòng)程序】本標(biāo)準(zhǔn)操作程序的變動(dòng)， 可由任一使用本 SOP的工作人員提出， 并報(bào)經(jīng)下述人員批準(zhǔn)簽字：專業(yè) 主管、科主任?！痉椒ā俊痉治銮百|(zhì)控】1. 人員培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)是人操作的，因此檢驗(yàn)人員需經(jīng)過培訓(xùn)，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識(shí)：1 檢驗(yàn)項(xiàng)目的基本原理 （ELISA 原理）；2 臨床意義；3 熟悉檢測(cè)技巧，了解易出差錯(cuò)的環(huán)節(jié)及難點(diǎn)；4 熟悉檢測(cè)試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；5 熟悉檢測(cè)儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識(shí)。6 某些特殊項(xiàng)目的檢測(cè)如抗 HIV 等需經(jīng)有

2、關(guān)部門組織的專門培訓(xùn)班，考試合格后持證上崗。試劑盒選擇】衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標(biāo)簽 的產(chǎn)品?！驹噭┖性u(píng)價(jià)】試劑評(píng)價(jià)需要有權(quán)威的血清考核盤（ Panel ）進(jìn)行檢測(cè)，價(jià)格昂貴，操作繁瑣，一般實(shí)驗(yàn)室不易 開展，可以通過以下信息，了解試劑質(zhì)量。1. 根據(jù)該試劑生物制品鑒定所的批批檢定報(bào)告， 了解其質(zhì)量水平， 按照質(zhì)量計(jì)劃選擇靈敏度高的 或特異性高的試劑；2. 通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源（基因工程或合成多肽），片段的組合（按比例混合 或化學(xué)合成），片段的長(zhǎng)短等判斷試劑的優(yōu)劣；3. 參考室間質(zhì)評(píng)報(bào)告中對(duì)試劑的評(píng)價(jià)結(jié)果，了解不同試劑的質(zhì)控

3、成績(jī)。4. 根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布的試劑評(píng)價(jià)結(jié)果，了解市場(chǎng)上試劑的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。【儀器質(zhì)控】為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。1. 移液器： ELISA加樣量?。?5-100 l ），其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取 刻度指示量的水，萬(wàn)分之一天平稱重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確，一般應(yīng)在±10%以內(nèi)；2. 水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計(jì)所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實(shí)測(cè)溫度是否一致，允許有± 1的誤差；3. 洗板機(jī)：每個(gè)廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過 2ul ，人工扣

4、板時(shí)，墊紙不 濕，定期檢查管孔是否堵塞；4. 酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測(cè)校正，使其保持良好的工作性能。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良 的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到 0.001 ，準(zhǔn)確性為± 1%，重復(fù)性達(dá) 0.5%。酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在 0.0002.000 ，新型號(hào)的酶標(biāo)儀上 限拓寬達(dá) 2.900 ，甚至更高。 超出可測(cè)上限的 A值常以 "*" 或"over" 或其它符號(hào)表示。 應(yīng)注意可測(cè)范圍 與線性范圍的不同，線性范圍常小于可

5、測(cè)范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍為 0.0002.900 ，而其線 性范圍僅 0.0002.000 ，這在定量 ELISA 中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。【酶標(biāo)儀校正程序】1. 濾光片波長(zhǎng)精度檢查：將不同波長(zhǎng)的濾光片從酶標(biāo)儀上卸下，用 UV-2201型紫外 -可見分光光 度計(jì)（波長(zhǎng)精度± 0.3nm）于可見光區(qū)對(duì)每個(gè)濾光片進(jìn)行掃描，其檢測(cè)值與標(biāo)定值之差為濾光片波長(zhǎng) 精度。一般酶標(biāo)儀無 585nm濾光片，可選用 550nm或 630nm濾光片。 450nm 濾光片的檢定選用普魯蘭 溶液（校正波長(zhǎng)為 630nm）。2. 通道差與孔間差檢測(cè)：通道差檢測(cè)是取一只酶標(biāo)板小孔杯（杯底須光滑，透明，無

6、污染以酶標(biāo) 板架作載體，將其（內(nèi)含 200ul 甲基橙溶液吸光度調(diào)至 0.500A 左右）置于 8 個(gè)通道的相應(yīng)位置，蒸 溜水調(diào)零，于 490nm處連續(xù)測(cè)三次 , 觀察其不同通道的檢測(cè)器測(cè)量結(jié)果的一致性，可用極差值來表示。 孔間差的測(cè)量是選擇同一廠家，同一批號(hào)酶標(biāo)2板條（8條共 96 孔）分別加入 200ul 甲基橙溶液（吸光度調(diào)至 0.100A 左右）先后置于同一通道，蒸溜水調(diào)零 , 于 490nm處檢測(cè)，其誤差大小用± 1.96s 衡 量。3. 零點(diǎn)飄移（穩(wěn)定性觀察）：取 8 只小孔杯分別置于 8 個(gè)通道的相應(yīng)位置，均加入 200ul 蒸餾 水并調(diào)零，于 490nm處每隔 30

7、分鐘測(cè)一次，觀察各個(gè)通道 4 小時(shí)內(nèi)吸光度的變化。4. 精密度評(píng)價(jià)： 每個(gè)通道 3只小杯分別加入 200ul 高中低 3 種不同濃度的甲基橙溶解， 蒸餾水調(diào)零，于 490nm作雙份平行測(cè)定，每日測(cè)二次（上下午各一次），連續(xù)測(cè)定20 天。分別計(jì)算其批內(nèi)精密度，日內(nèi)批精密度 , 日間精密度和總精密度及相應(yīng)的 CV值。5. 線性測(cè)定：用電子天平精確稱取甲基橙配制 5個(gè)系列的溶液，于490nm平行測(cè) 8次，取其均值。 計(jì)算其回歸方程，相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)誤差 s，并用± 1.96s 表示樣品測(cè)量的誤差范圍 . 雙波長(zhǎng)測(cè)定評(píng) 價(jià)：取一分甲基橙溶液，分別加入 3 種不同濃度的溶血液（測(cè)定波長(zhǎng)為 4

8、90nm，校正波長(zhǎng)為 585nm）， 先后于 8個(gè)通道檢測(cè)，每個(gè)通道測(cè) 3 次，比較各組之間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以考察雙波長(zhǎng)消除干擾 組分的效果?！緲?biāo)本的采集和保存】1. 標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)盡量避免溶血，因紅細(xì)胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié) 果，以 HRP為標(biāo)記的 ELISA 測(cè)定中，溶血標(biāo)本會(huì)增加非特異性顯色造成假陽(yáng)性。2. 長(zhǎng)菌的標(biāo)本同樣的道理也易產(chǎn)生假陽(yáng)性，因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。3. 抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽(yáng)性， 建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝 素抗凝劑。4. 標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長(zhǎng)易導(dǎo)致血清 IgG 聚合，使間接法的試劑本

9、底加深，一般血清置4冰箱 5 天內(nèi)完成測(cè)試。如需保存一周以上則要 - 20冰凍保存，凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮， 分布不均， 融解時(shí)應(yīng)上下顛倒充分混勻， 同時(shí)避免氣泡。 可上下顛倒混和， 不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。 反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。5. ELISA 的靈敏度1ng/ml 水平上,標(biāo)本間的污染要盡量避免，尤其不應(yīng)與生化試驗(yàn)用同一管標(biāo) 本。分析中質(zhì)控】ELISA 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn) 真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮 ELISA的高靈敏，強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此 , 應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序 （SOP）。1.

10、 加樣1 加樣應(yīng)用微量移液器 （加樣槍） 按規(guī)定的量加入微孔板底部， 避免加在孔壁上部， 不可濺出， 不可產(chǎn)生氣泡。2 每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交*污染; 干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。3 樣本稀釋， 目的是為了減少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后加樣本， 特別注意加樣 后要在微量振蕩器上振蕩 30 秒鐘，同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均 需振蕩混勻。4 如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。2. 溫育1 抗原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下（ 37°C），經(jīng)過一定的時(shí)間才能達(dá)到反應(yīng)的平衡點(diǎn)2 ELISA 邊緣效應(yīng)是由溫育

11、形成的。 所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。 水要浸至板條的 1/3 處。3 反應(yīng)板不宜疊放， 注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定控制，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊 板同時(shí)測(cè)定。3. 洗滌1 手工洗滌一般采用浸泡方法： 1）甩去孔內(nèi)反應(yīng)液； 2 ）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即 甩去）； 3）微孔重新注滿洗液后浸泡 2-3 分鐘，間歇搖動(dòng)； 4）甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。重復(fù)以上操作至少 5 次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用2 洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地插入孔 底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時(shí)要設(shè)置一定的浸泡時(shí)間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍

12、板有較多殘留液時(shí)應(yīng)再用手 工洗 2 次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。4. 顯色1 HRP 催化底物的一步呈色反應(yīng)，同樣需要一定的時(shí)間和溫度，2 一定要按照說明書規(guī)定的時(shí)間溫度（一般為37°C， 10-15 分鐘）恒定反應(yīng)后終止3 或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達(dá) 0.2 左右使的時(shí)間而恒定反應(yīng)時(shí)間 .5. 酶標(biāo)儀判讀結(jié)果1. 顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（ 30 分鐘內(nèi)）。2. 常見的顯色系統(tǒng)有 OPD和 TMB二種，以后者最為常見， 而 TMB酸不易終止因此必須盡快比色以 免影響結(jié)果。 OPD終止后顯棕色，測(cè)定波長(zhǎng)為 490nm；TMB終止后顯黃色，測(cè)定波長(zhǎng)為 450nm，二

13、種底 物的校正波長(zhǎng)均用 630nm。3. 使用雙波長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。 同時(shí)要注意反應(yīng)板應(yīng)用紙吸干后才 能置酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片?！痉治龊筚|(zhì)控】【報(bào)告方式】1. 定性試驗(yàn)：國(guó)內(nèi)外為便于統(tǒng)一計(jì)算，一律按S/COV方式報(bào)告， S為標(biāo)本 A值， COV即 Cut Off值（或 COV）1 夾心法和間接法以 S/COV1為陽(yáng)性；競(jìng)爭(zhēng)法與中和法以 S/COV 1 為陽(yáng)性2 COV 的計(jì)算公式以試劑盒說明書的為準(zhǔn)常見的有：A）COV=2.1×N（當(dāng) N 不足 0.05 時(shí)按 0.05 計(jì)），此公式由 P/N>2.1 換算而來，常用于夾心法。

14、B）COV=0.5×N，從抑止率公式換算而來，常用于競(jìng)爭(zhēng)，中和法。C）COV=N+C（ C為常數(shù)），用于間接法。D）COV=C×P+N（ C為常數(shù)），用于間接法。此公式最客觀，但對(duì)廠家要求很高，陰陽(yáng)性對(duì)照測(cè) 定值要基本恒定。2. 定量分析：嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。1 用已知量的系列標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對(duì)量或單位表示。ELISA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測(cè)標(biāo)本做在同一塊板上。2 現(xiàn)有的 ELISA 定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線， 要得到精確的結(jié)果實(shí)屬 不易?！居涗洝? 所有實(shí)驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔； 所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊(cè)； 原始登記表應(yīng)記錄試

15、劑來源、 批號(hào)；質(zhì)控血清的來源及測(cè)定值并注明是否在控；簽上實(shí)驗(yàn)者姓名及審核者姓名。2 如試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床診斷有決定意義，其樣本應(yīng)保留，至少與病歷保存期一致【定性試驗(yàn)】ELISA 定性試驗(yàn)的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)，因此QC要保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察靈敏度而無法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法：將試 劑盒所設(shè)的陰陽(yáng)性對(duì)照作為內(nèi)對(duì)照指示反應(yīng)；另設(shè)臨界值、高值質(zhì)控血清，正常人血清作為外對(duì)照，與標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)，臨界值 S/C.O1，高值質(zhì)控血清 S/C.O10，正常人血清 A 值在 0.050.07 之間陽(yáng)性質(zhì)控血清失控（臨界值為靈敏度，高值為 "HOOK"效應(yīng)監(jiān)控）應(yīng)重做陰性標(biāo)本；陰性對(duì)照失控應(yīng)重 做陽(yáng)性標(biāo)本。以表格式記錄每塊板的外對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作為QC資料存檔?！径吭囼?yàn)】ELISA 定量試驗(yàn)常見于腫瘤因子（如 AFP， CEA，CA系列），激素類，免疫球蛋白類，這些物質(zhì) 在體內(nèi)有一定的量（正常范圍），超出這個(gè)量才呈病理情況，故需