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文檔簡(jiǎn)介
1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5以的制備,質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及提取一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?, 了解和掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法的原理和操作技術(shù)。2, 了解和掌握質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原理和操作步驟。3, 掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法,以及提取過程中各試劑的作用。二實(shí)驗(yàn)原理1, 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的原理感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài),將正在生長(zhǎng)的大腸桿菌處于0C的CaCl2低滲溶液中,會(huì)膨脹成球形,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn) 出感受態(tài)。2, 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理在0C下外源DNA可吸附到感受態(tài)細(xì)胞表面,短時(shí)間的熱刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞吸收DNA轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的大腸桿菌經(jīng)培養(yǎng)可以使質(zhì)粒編碼的抗生素
2、抗性基因得到表達(dá),因此,轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞可以在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上涂布生長(zhǎng),而沒有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無法生長(zhǎng)。3, 質(zhì)粒提取原理質(zhì)粒的分離是利用質(zhì)粒 DN面染色體DNA在變性與復(fù)性中的差異來達(dá)到的目的。當(dāng)菌體在NaOHffi SDS液中裂解時(shí),蛋白質(zhì)與 DN8生變性,由于染色體 DNAf質(zhì)粒 DNA樸構(gòu)型不同,染色體DN網(wǎng)螺旋結(jié)構(gòu)解開,而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖被斷裂,但兩條互補(bǔ)鏈彼此相盤繞仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入中和液后,溶液pH調(diào)恢復(fù)至中性,在高鹽濃度的情況下,染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等形成沉淀;不同的是,質(zhì)粒 DNAM性迅速而準(zhǔn)確,保持可
3、溶狀態(tài)而留在上清中。這樣,通過 離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA RNA蛋白質(zhì)。除去沉淀后上清中的質(zhì)粒可用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒 DNA三儀器,材料及試劑儀器:恒溫培養(yǎng)箱,離心機(jī),恒溫?fù)u床,超凈工作臺(tái),高壓滅菌鍋,電泳儀,水浴鍋等材料:大腸桿菌 DH5a菌株,大腸桿菌 BL21菌株,pCM驚粒試劑:Solution I , Solution II , Solution III , 1 mol/L CaCl2 , TE緩沖液,70吃 醇,酚:氯仿(1:1 )等。四實(shí)驗(yàn)步驟1, 試劑的準(zhǔn)備Solution I: 1 ,量取下列溶液,置于1L燒杯中。1MTris-HCL(pH8.0)25 m
4、L0.5 M EDTA(pH8.0)20mL20 % Glucose (1.11M )45mLdH2O910 ml2, 高溫高壓火菌后,4C保存。Solution II : 1,量取下列溶液,置于500mL燒杯中。10% SDS 50mL2N NaOH 50mL2,加滅菌水定容至 500 mL,充分混勻。Solution III : 1,量取下列溶液,置于 500mL燒杯中。KOAc 147gCH3COOH57.5 g2 ,加入300ml去離子水后攪拌溶解。3 ,加去離子水將溶液定容至 500。4 ,局溫局壓火菌后,4(2保存。LB培養(yǎng)基:1 ,稱取下列試劑,置于 1L燒杯中。Tryptone
5、 10gYeast Extract 5gNaCl10g2, 加入約800ml的去離子水,充分?jǐn)嚢枞芙狻?, 滴加 5NNaOH(約 0.2ml ),調(diào)節(jié) pH值至 7.0。4,加去離子水將培養(yǎng)基定容至1L。5 ,高溫高壓火菌后,4C保存。10XTE Buffer : 1,量取下列溶液,置于 1L燒杯中。1 M Tris-HCl Buffer(pH8.0)100ml500mM EDTA(pH8.0)20ml2,向燒杯中加入約 800ml去離子水,均勻混合。3, 將溶液定容至1L后,高溫高壓滅菌。4,室溫保存。2感受態(tài)細(xì)胞制備1) 從-80 C冰柜中取出一支凍存的大腸桿菌DH5a菌株,在冰塊上解凍
6、后,于事先照過紫外的超凈臺(tái)中,用無菌接種環(huán)輕輕蘸取菌種后,在無抗平板上分區(qū)劃線,將菌種迅速放回-80 C保存。平板做好標(biāo)記后,于37C培養(yǎng)約16小時(shí),該細(xì)菌菌落在 LB培養(yǎng)基上為1-2mm的透明的淡黃色菌落,有特殊的臭味。2)在照過紫外的超凈臺(tái)中,用滅菌的牙簽挑取單個(gè)菌落,接種入裝有1mlLB培養(yǎng)液的1.5mlEP管中,封口膜封好,于 37C恒溫?fù)u床培養(yǎng)10-12小時(shí),直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3) 將該時(shí)期的細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)液中,37 C, 220rpm ,震蕩擴(kuò)大培養(yǎng)約 3h,測(cè)細(xì)菌 OD600,以0.3-0.4之間最佳。4) 將擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)物在冰上冷卻10min,轉(zhuǎn)入50m
7、l離心管,4 C ,4000rmp離心10min。5)倒凈上清液,流盡殘余液體,加入 10ml預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液(使細(xì)菌膨脹成球形,外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面)輕輕懸浮細(xì)胞,冰浴 30min。6)4 C ,4000rmp 離心 10min。7)棄去上清,加入 2ml預(yù)冷的15%甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液再次懸浮細(xì)胞,即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液。8)每個(gè)1.5mlEP管分裝200 的感受態(tài)細(xì)胞,-70C保存。3轉(zhuǎn)化1)將感受態(tài)細(xì)胞從-70 C拿出,放冰塊上解凍。2) 在超凈工作臺(tái)中,取空質(zhì)粒1加去離子水9 稀釋,加入到1
8、00 感受態(tài)細(xì)胞中,冰上 放置30min。3) 42C,熱激60s (促進(jìn)細(xì)胞對(duì) DNA的吸收),迅速再在冰上放置 3min。4)加入不含 Amp的LB培養(yǎng)液890心37 C振搖1h,使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì) 粒編碼的抗性基因(Amp )。5)從每管中取100 培養(yǎng)液鋪至LBAmp培養(yǎng)板,并涂布均勻。6) 室溫放置20min,使液體吸收,37C倒置培養(yǎng)16h。7) 挑取單個(gè)菌落,接種于加有Amp的2mlLB培養(yǎng)液中,37C, 220rpm ,震蕩培養(yǎng)約16h。4質(zhì)粒提?。▔A裂解法)1) 加1.5ml培養(yǎng)物于離心管中,4C ,12000rmp/min離心30s。2)倒去上清液,倒置于吸水
9、紙上干燥。3) 加入100 l4預(yù)冷的Solution I重懸,用手劇烈震蕩 15s。(低濃度的葡萄糖溶液使細(xì)胞 處于低滲狀態(tài)而細(xì)胞膨脹; 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度, 減少抽提過程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞 DNA。 EDTA的作用是螯合掉 Mg2+、Ca2+等二價(jià)金屬離子,防止 DNA酶對(duì) 質(zhì)粒分子的降解作用。Tris?Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍)。4) 緩慢加入200 新配制的Solution II ,上下顛倒5次。(SDS的作用:破壞細(xì)胞膜;解聚 核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性。NaOH(pH>12)的作用:破壞氫鍵,使DNA分子變性)。5) 加入150 用冰預(yù)
10、冷的Solution III ,蓋緊管口,上下顛倒 10次,放冰上3-5分鐘。(:由 KAc與HAc組成,是pH值為5.5的高鹽溶液。能中和溶液 II的堿性,使 DNA復(fù)性。K+ 離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì),很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離)。6)4 C ,12000rmp/min離心5min ,吸上清400 移到另一離心管中。7) 加等量酚:氯仿(各200心(使蛋白質(zhì)變性,并使液相和有機(jī)相分離),震蕩15min。8)4C ,12000rmp/min離心2min ,將上清液移到另一離心管,切勿吸到下層
11、溶液,取 300 g 即可。9) 加入2倍體積的無水乙醇 (奪取DNA外的水合層使 DNA聚合而沉淀),室溫放置2min , 4C ,12000rmp/min離心5min ,上下顛倒 5次使其反應(yīng)充分。10)棄去上清,將離心管倒置于吸水紙上。11) 加入1ml70%乙醇(與無水乙醇的作用類似,同時(shí)可以清洗DNA,溶解與DNA 一起沉淀下來的離子。),用槍頭把沉淀吸起來,4 C ,12000rmp/min離心2min。12)棄上清,倒置于吸水紙上。13) 各加入1 lRNase(降解RNA污染物),30 lTE14) 封口膜封上,37C孵育1h。5瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果用微量分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒濃度,濃
12、度在2000ng/ 時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。1)制備瓊脂糖凝膠:稱取 0.8g瓊脂糖,加入100ml1 >TAE緩沖液,置微波爐中加熱至完全 融化,取出搖勻,即為瓊脂糖凝膠液, 冷卻至50-60 C后倒入到放有梳子的有機(jī)玻璃內(nèi)槽中, 形成一層均勻的膠面,凝固后,拔出梳子,放入加有電泳緩沖液的電泳槽中。2)加樣:第一孔加入 6IMarker其余幾孔加入混有 loading buffer的質(zhì)粒。3)電流80mA,電壓110V,電泳40min。4)電泳結(jié)束后看結(jié)果。五結(jié)果分析M 12345678910M : 2000 DNA marker2,5,8孔為轉(zhuǎn)化入BL21細(xì)菌的質(zhì)粒。1,3,4,6,7,9,10孔為轉(zhuǎn)化入DH5 a細(xì)胞的質(zhì)粒。正常質(zhì)粒是閉合的雙鏈 DNA。
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