兩種愈傷組織生理生化特性和形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

1、兩種愈傷組織生理生化特性和形態(tài)結(jié)構(gòu)比較： In order to learn the key factors of callus development on single cell clone ， characteristics of physiology and biochemistry and morphological structure of two types of alfalfa callus was studied. The results showed that the cell membrane permeability and malondialdehyde conten

2、t was same for the two types of callus； but theirsoluble sugar content and peroxidase activity in cells was very different ， for the soluble sugar content ： soft callus > huge callus ， and soft callus was 2.09 times of huge callus ； for peroxidase activity ： huge callus > soft callus ， and hug

3、e callus was 1.35 times of soft callus. Huge callus cells were larger， loosely arranged ， cellvacuolization and cytoplasm was thiner than soft callus. However， soft callus cells were smaller， looselyarranged ， cell vacuoles was smaller and cytoplasm was thicker than hug callus. Huge cells had the sa

4、me membrane metabolic with soft cells ， but soft cells had higher sugar accumulation than huge cells， and soft cells metabolismwere vigorous ， while huge cells were more aging.近年來，對于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚的發(fā)生研究取得了較大的進(jìn)展 1-3 。但是，由許多胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的 體細(xì)胞細(xì)胞系由于其起源的雜合性，往往缺少穩(wěn)定性 4-5 。而 誘導(dǎo)外植體分裂形成形態(tài)結(jié)構(gòu)一致的愈傷組織，即利用均質(zhì)的、 松散的愈傷組織

5、可以建立單細(xì)胞克隆純系， 就具有更好的穩(wěn)定性 和非嵌合性 6 。目前，培養(yǎng)這種均質(zhì)的、松散的愈傷組織體系 的研究較少 7 。這種單細(xì)胞克隆體系與愈傷組織的生理代謝有 密切關(guān)系 8 。李茜 6 的研究認(rèn)為，與愈傷組織的可溶性蛋白質(zhì)、 可溶性糖和淀粉含量及抗氧化物酶（ POD， SOD，CAT） 活性有 關(guān)。陳超等9認(rèn)為，與SOD CAT總谷胱甘肽氧化物酶的活力、 超氧化物和丙二醛含量有關(guān)。 筆者研究了兩種形態(tài)的愈傷組織的 細(xì)胞膜透性、丙二醛含量、細(xì)胞內(nèi)可溶性糖含量和過氧化物酶 POD舌性等生理生化變化，比較了他們的形態(tài)差異，研究了具有 胚性愈傷組織特點的、 均質(zhì)愈傷組織的特性， 為單克隆細(xì)胞系的

6、 建立提供了依據(jù)。1 材料和方法1.1 材 料青睞苜蓿種子來自于中國農(nóng)科院， 選取色澤良好飽滿的種子 播種于天津農(nóng)學(xué)院溫室，播種基質(zhì)為蛭石，獲取實生苗。在超凈臺中剪取青睞苜蓿實生苗的葉片，將葉片邊緣剪掉， 并剪成0.5 cm2的小塊作為外植體，備用。將剪好的外植體消毒， 分別接種到 1/2 MS + 1.0 mg?L-1 2 ， 4-D + 150 mg?L-1 Vc + 15 g?L-1 蔗糖培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)巨大型愈傷組織；接種到 MS + 0.25mg?L-1 2，4-D + 0.5 mg?L-1KT+150 mg?L-1Vc+30 g?L-1蔗糖培養(yǎng)基上，進(jìn)行松散型愈傷組織的誘導(dǎo)（詳細(xì)見專

7、利201310118903.5 ）。培養(yǎng)條件為：溫度2024 °C,光照強度500 1 000 lx ， 24 h 光照。獲得的愈傷組織分別進(jìn)行細(xì)胞膜透性（電導(dǎo)率法）、可溶性 糖（蒽酮法） 、丙二醛含量 （硫代巴比妥酸比色法和用 Lambda35 紫外分光光度計測定）和 POD酶活性（采用愈創(chuàng)木酚比色法和 Lambda 35紫外分光光度計測定）測定。2 結(jié)果與分析2.1 苜蓿兩種愈傷組織細(xì)胞膜透性的比較由圖 1 可知，苜蓿愈傷組織中巨大型細(xì)胞愈傷組織的膜透性 為 54.30%，松散型細(xì)胞的愈傷組織膜透性為54.74%個百分點，僅比巨大型的愈傷組織的細(xì)胞膜透性高出 0.44 個百分點。

8、2.2 苜蓿兩種類型愈傷組織丙二醛含量的比較由圖 2可知，苜蓿巨大型愈傷組織的丙二醛含量為0.001 406mol?g-1 ，松散型的愈傷組織的丙二醛含量為 0.001 506 mol?g-1 ， 松散型丙二醛含量比巨大型的丙二醛含量僅僅高出 0.000 1 mol?g-1 ，基本無差異。2.3 苜蓿兩種類型愈傷組織可溶性糖含量的比較由圖 3 可知，巨大型細(xì)胞愈傷組織的可溶性糖含量是 0.56%， 松散型愈傷組織的可溶性糖含量為1.17%，松散型愈傷組織比巨大型高 0.61 個百分點，是巨大型的 2.09 倍，兩者有較大的差異。 這一結(jié)果與霍合強 10 的報道一致。比較兩種愈傷組織的形態(tài)解剖結(jié)

9、構(gòu)（圖1、 2）可以看出，巨大型愈傷組織的細(xì)胞中含有中央大液泡， 液泡化程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 松散型愈傷組織， 細(xì)胞質(zhì)濃度相對來說較低。 而松散型愈傷組織 細(xì)胞中僅有一些小液泡，細(xì)胞質(zhì)濃，在細(xì)胞中占的比例大。這可 能是巨大型愈傷組織細(xì)胞中可溶性糖含量低的原因之一。2.4苜蓿兩種類型愈傷組織中 POD酶活性比較由圖4可知，巨大型愈傷組織細(xì)胞的 POD酶活性是6 623.7U?g-1?min-1，松散型愈傷組織細(xì)胞的 POD酶活性是4 888.7 U?g-1?mi n-1，巨大型愈傷組織細(xì)胞 POD酶活性是松散型的1.35 倍，差異較大。過氧化物酶廣泛存在于植物體中， 是活性較高的一種酶。 它 與呼吸作用

10、、 光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。 在植物生長 發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高， 幼嫩組織中活性較弱。 過氧化物酶常作為組織老化的一種生理指 標(biāo)11 。所以，巨大型愈傷組織細(xì)胞的 POD酶活性高，表明其組織較 松散型愈傷組織老化或衰老程度高。圖1、2的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也表明， 巨大型愈傷組織的細(xì)胞液泡化程度和細(xì)胞的分化程度 均較松散型的高，細(xì)胞也較大，細(xì)胞質(zhì)稀薄、細(xì)胞質(zhì)濃度較低， 葉綠體等細(xì)胞器也較少，代謝活躍程度較低?？傊?，巨大型和松散型這兩種類型的愈傷組織在細(xì)胞膜透性 和丙二醛含量上沒有顯著差異，但在可溶性糖含量和POD酶活性 兩項指標(biāo)上差異比較大， 其中松散型

11、愈傷組織的可溶性糖積累高 于巨大型，POD酶活性低于巨大型愈傷組織，即巨大型愈傷組織 碳水化合物的積累較少，細(xì)胞的衰老程度較高。因此，松散型愈 傷組織是代謝更加旺盛的愈傷組織。3 結(jié)論與討論 巨大型和松散型這兩種類型的愈傷組織的細(xì)胞膜透性差異 不大（54%-55%，與兩者均為薄壁細(xì)胞，且膜代謝反應(yīng)基本相 同有關(guān)。比較兩種愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖 1、 2）可以看出，松散 型愈傷組織細(xì)胞呈淺白或白色，半透明，細(xì)胞壁??；巨大型愈傷 組織細(xì)胞呈淺黃色，細(xì)胞較大，細(xì)胞壁薄。此外，兩種愈傷組織 的膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量也無差異。 說明兩者的生物膜完好 程度或生物膜受外界影響的程度也相同。 因為丙二醛是膜脂過氧 化的終