電鏡技術(shù)及超薄切片技術(shù)研究生醫(yī)學(xué)

1、會計(jì)學(xué)1電鏡技術(shù)及超薄切片技術(shù)研究生醫(yī)學(xué)電鏡技術(shù)及超薄切片技術(shù)研究生醫(yī)學(xué) 1924年，法國物理學(xué)家Broglie提出了“電子與光一樣， 具有波動性“的假說，并計(jì)算出電磁波長為0.005nm. 1926年，德國科學(xué)家Busch發(fā)現(xiàn)了帶電粒子在電場或磁 場中偏轉(zhuǎn)聚焦的現(xiàn)象，類似于光線通過透鏡可被聚焦一樣。 19281931年間，德國年輕的大學(xué)生Ruska測量了磁透 鏡的聚焦特性，并開展了電子放大成像的研究，終于在1938 年成功研制了世界上第一臺真正的電子顯微鏡，放大倍數(shù)為 1200倍，被譽(yù)為電子顯微鏡之父。，并在1986年獲得諾貝爾 獎(jiǎng)。 20世紀(jì)50年代初到60年代末期，電鏡發(fā)展很快，從性能

2、到構(gòu)造都得到很大的改進(jìn)，特別是分辨本領(lǐng)得到大幅度提高， 達(dá)到1nm左右，到80年代的點(diǎn)分辨率已接近0.1nm，最新研制 的超高壓透射電鏡的點(diǎn)分辨率可達(dá)0.005nm。1、透射電子顯微鏡2、掃描電子顯微鏡3、分析電子顯微鏡4、超高壓電子顯微鏡5、掃描探針顯微鏡 （掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡、掃描光子顯微鏡等） 一、 電子顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu) 光的衍射現(xiàn)象： 由于光具有波動性，當(dāng)光線通過小孔或小孔光源經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)成象會產(chǎn)生衍射。其圖案是:中央部分一個(gè)亮斑，在其周圍有明暗交替的園環(huán)。2D D =1、人眼在明視距離250mm處能分辨0.2mm的兩點(diǎn)。 油鏡最小能分辨0.2 m的兩點(diǎn)。 則油鏡理論最大放大

3、能力為： 0.2mm / 0.2 m = 10002、假如一臺電鏡的點(diǎn)分辨率為0.1nm,則其理論放大 倍數(shù)為：0.2mm / 0.1nm = 2x1063、H-7500型透射電鏡的點(diǎn)分辨率為0.24nm,則其理 論放大倍數(shù)為：0.2mm / 0.24nm = 0.83x106。而 其有效放大倍數(shù)為 0.6x106 光線通過二個(gè)比較靠近的小孔時(shí)，這二個(gè)小孔的衍射圖會重疊在一起。當(dāng)一個(gè)衍射圖的中央亮斑正好落在另一個(gè)衍射圖的第一暗環(huán)中心時(shí)，這二個(gè)點(diǎn)剛可以分辯。這就是顯微鏡分辯本領(lǐng)的 瑞利準(zhǔn)則瑞利準(zhǔn)則。運(yùn)動著的電子所產(chǎn)生電磁波長為： = (n m) 如 V = 50000 v 則 = 0.005 n

4、m= 0.000005m 是光的=500nm 的10萬分之一，大大減少了衍射光斑D的值。 光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡在工作原理上的比較： 光學(xué)顯微鏡是利用玻璃制作的透鏡對光進(jìn)行折射，將一物點(diǎn)發(fā)出不同角度的光線最終會聚成一個(gè)像點(diǎn)。 電子顯微鏡是利用電場或磁場折射電子束，達(dá)到成像目的。 光 源聚光鏡樣 品物 鏡 投影鏡最終象透射電子顯微鏡 光學(xué)顯微鏡 鏡筒內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖鏡筒內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖： 1) 照明系統(tǒng)： 電子槍 聚光鏡 2） 樣品室 3） 成象系統(tǒng)： 物鏡 中間鏡 投影鏡 4） 觀察記錄系統(tǒng)： 觀察室 照相機(jī) 一、電子顯微鏡的照明系統(tǒng)1、電子槍 一般安裝在鏡筒的頂端，是一個(gè)由陰極、柵極和陽極三個(gè)部

5、分組成的結(jié)構(gòu)。大多數(shù)陰極為熱陰極。燈絲為鎢燈絲，呈V形，尖端向下，其余兩端連接電源。2、聚光鏡 由鐵殼包裹的線圈構(gòu)成，通入電流后乃形成電磁場，使由電子槍發(fā)出的電子束進(jìn)一步密集聚攏，以增強(qiáng)其照明效果。聚光鏡的中央位置裝有極靴，其作用是籍以增強(qiáng)磁場強(qiáng)度，而磁場強(qiáng)度可通過改變所加電流大小來調(diào)節(jié)，以達(dá)到根據(jù)需要調(diào)節(jié)放大倍率和對所形成圖象進(jìn)行聚焦的目的。 一般電鏡都設(shè)有二級聚光鏡。二、電子顯微鏡的成像系統(tǒng)1、物鏡 由鐵殼包裹的線圈組成，是電鏡成像系統(tǒng)的關(guān)鍵性部件。在物鏡中心位置同樣裝有精密度極高的極靴，以及要求很高的肖像散部件，以盡量消除成像過程中難以完全避免的像散現(xiàn)象，保證成像的清晰度。在物鏡的后焦面

6、裝有可動光闌片，可根據(jù)具體情況來調(diào)整光闌孔的大小。2、中間鏡 也是由鐵殼包裹的線圈組成，位于物鏡和投影鏡之間，作用是將物鏡所成的放大像進(jìn)一步放大。目前高檔的電鏡可設(shè)有三極中間鏡。3、投影鏡 也是由鐵殼包裹的線圈組成，作用是將以上成像進(jìn)一步放大并投影于熒光屏上，激發(fā)熒光，形成影象。三、觀察記錄系統(tǒng)1、熒光屏 為圓形平面結(jié)構(gòu)，上面涂以熒光粉，當(dāng)高速電子撞擊其表面時(shí)，便激發(fā)出熒光，從而使觀察者能通過含鉛玻璃窗口直接看到影象。2、照相室 在熒光屏的下邊，裝有電鏡軟片，通過電子束直接轟擊軟片表面而使軟片爆光，從而使觀察影象以底片或照片的形式保存下來。四、真空系統(tǒng) 由低真空和高真空兩極真空泵構(gòu)成。前者稱為

7、機(jī)械泵，排氣氣壓達(dá)0.01mmHg;后者稱為擴(kuò)散泵，排氣氣壓可達(dá)0.0001mmHg以下。 真空系統(tǒng)的作用是使鏡筒內(nèi)部獲得高真空。如果鏡筒內(nèi)真空度較差，將會: 1）氣體分子與高速電子相 互作用，隨機(jī)地散射電子，降低象的反差。 2）電子槍中存在殘余氣體，會產(chǎn)生電離和放電，引起電子束發(fā)射不穩(wěn)定。 3）殘余產(chǎn)體與白燈絲發(fā)生作用，降低燈絲壽命。 4） 殘余產(chǎn)體在樣品周圍會污染樣品。 五、供電系統(tǒng) 它是由以下三個(gè)部分組成 1）高壓電源：使電子獲得一定的速度。通常電壓為25KV、 50KV、 75KV 和 100 KV。 2）磁透鏡激勵(lì)磁電源：它提供了磁透鏡所必需的電源，從而使磁透鏡周圍有一個(gè)特定形狀的磁

8、場。 3）輔助電源：例如真空系統(tǒng)控制電源、調(diào)焦和嚗光裝置、照相機(jī)自動控制和記數(shù)電路等等。六、輔助系統(tǒng) 1）水冷系統(tǒng)：是用水冷卻油擴(kuò)散泵、磁透鏡的線圈等，保證設(shè)備正常工作。 2）氣動系統(tǒng)：采用壓縮空氣作為動力，將各種閥門按程序要求打開或關(guān)閉，完成所須任務(wù)。透射與掃描電鏡原理圖解一、探查系統(tǒng)探查系統(tǒng)：由電子槍、電磁透鏡組成。 電子槍發(fā)射電子束（加速電壓在1 50KV ），經(jīng)過電磁透鏡的作用，射擊標(biāo)本表面，使之產(chǎn)生二次電子。二、顯示系統(tǒng)顯示系統(tǒng)：電子檢測器，閃爍器、光電倍增器以及顯示屏組成。 由電子束激發(fā)的二次電子被位于檢測器前端的柵極所吸引，并被強(qiáng)正電場加速飛向閃爍器。當(dāng)電子擊中閃爍器時(shí)，后者乃產(chǎn)

9、生光子，光子沿導(dǎo)光管引向光電倍增器，并在此產(chǎn)生光電子，此信號經(jīng)放大后被傳輸?shù)疥帢O射線管（顯示屏），從而在此成像。透射電子顯微鏡拍攝的照片掃描電子顯微鏡拍攝的照片 電子束的穿透能力一般較弱，大多數(shù)標(biāo)本無法直接在電鏡下觀察，必須把樣品切成厚度為 101000nm 的薄片。這種切片稱為超薄切片，是電鏡觀察生物樣品常用方法之一。(1) 超薄切片技術(shù)二、 透射電子顯微鏡樣品制備 1）取材 取材的要點(diǎn)是快、小、冷、準(zhǔn)快、小、冷、準(zhǔn)，組織要 新鮮。 快：取材時(shí)間在12分鐘以內(nèi)完成； 小：體積大小在1立方毫米左右或橫切面 為1平方毫米的長條形； 冷：固定液溫度在4攝氏度左右。 準(zhǔn)：取材部位要準(zhǔn)確，盡量取材于所

10、要觀察的部位。 1組織塊固定：適用活組織檢查，如腎、肝、胃腸道等等。常規(guī)采用戊二醛鋨酸雙重固定法。 2游離細(xì)胞的固定：適用于培養(yǎng)細(xì)胞、周圍血、骨髓、胸腹水或其他滲出液。如為貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)先用橡皮刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)管壁上輕輕刮下，或用酶消化，使細(xì)胞脫離管壁，然后按以上方法固定。有離心法和懸浮制備法。 3. 原位固定法：在組織表面滴固定液或注射固定液的方法。 4灌注固定法 ：即通過血管將固定液灌注到所要固定的組織中。通常采用的固定劑為2%4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液。 化學(xué)固定方式分：化學(xué)固定方式分：常用固定劑的性質(zhì)常用固定劑的性質(zhì) 1四氧化鋨四氧化鋨 (osmium tetroxid

11、e，OsO4) :四氧化鋨又名鋨酸，是強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，因而對于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外，四氧化鋨還能固定脂蛋白，使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng)，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化鋨固定劑有強(qiáng)烈的電子染色作用，用它固定的樣品圖象反差較好。固定的時(shí)間一般為1小時(shí)左右,其蒸氣對皮膚、呼吸道粘膜及眼睛角膜有傷害作用。注意通風(fēng)和避光。 2戊二醛戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2) 戊二醛的優(yōu)點(diǎn)是對糖原、糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等有較好的固定作用，對組織和細(xì)胞

12、的穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，還能保存某些酶的活力，長時(shí)間的固定(幾周甚至12個(gè)月)不會使組織變脆。缺點(diǎn)是不能保存脂肪，沒有電子染色作用，對細(xì)胞膜的顯示較差。 另外還有10%福爾馬林 、5%高錳酸鉀等。 5）脫水）脫水 為了保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部，必須事先將組織內(nèi)的水分驅(qū)除干凈，即用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來取代水，常用的脫水劑是乙醇和丙酮。急驟的脫水會引起細(xì)胞的收縮，因此，脫水應(yīng)梯度進(jìn)行：70% 丙酮15分鐘，80% 丙酮15分鐘，90%丙酮15分鐘，100%丙酮0分鐘(二次)。 6）浸泡與包埋）浸泡與包埋 浸泡：使某種適宜的液體介質(zhì)（包埋劑） 滲入組織塊取代脫水劑。 包埋：使浸入的介

13、質(zhì)經(jīng)高溫處理后聚合為堅(jiān)固體，利于超薄切片。 常用包埋劑：Epon-812環(huán)氧樹脂、 DDSA、MNA以及加速劑DMP-30等。 （高溫處理） 液體固體 包埋劑的理想性質(zhì) 理想的包埋劑應(yīng)具有以下性質(zhì)： (1)粘度低，容易滲入組織； (2)聚合均勻而充分，聚合前后體積變化小； (3)有良好的切割性能； (4)能耐受電子束轟擊，高溫下不變形； (5)對細(xì)胞成分抽提少，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存良好； (6)在電鏡的高倍放大下，本身不顯示任何結(jié)構(gòu)； (7)材料來源豐富、易得，價(jià)格低廉，對人體無害。透射電鏡樣品制備操作流程： 取材漂洗（生理鹽水）前固定（2.5%戊二醛，4C冰箱2小時(shí)以上）漂洗（0.1M 磷酸緩沖液，

14、3次，45分鐘）后固定(1%鋨酸1小時(shí)左右）漂洗（0.1M 磷酸緩沖液，3次，45分鐘）塊染（1%醋酸鈾2小時(shí)）梯度脫水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分鐘， 100% 2次，各10分鐘）浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 C烘箱2小時(shí)；丙酮：包埋液=1：4， 37C烘箱過夜；純包埋液45C烘箱2小時(shí)）包埋聚合（45C烘箱3小時(shí)，65C烘箱48小時(shí)）常用包埋劑 1環(huán)氧樹脂Epon 812:為進(jìn)口分裝，聚合前后體積變化小(收縮率為2%5%)，切片在電子束照射下穩(wěn)定，能較好地保存細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)。但操作條件要求較嚴(yán)格，如組織塊脫水要徹底，包埋時(shí)要注意防潮及防止氣泡產(chǎn)生，聚合時(shí)溫度要

15、控制好等。通常與硬化劑MNA、增塑劑DDSA以及加速劑DMP-30混合使用。 2、環(huán)氧樹脂Epon 618：國產(chǎn)，效果不如前者。超薄切片超薄切片 1、切片前的準(zhǔn)備：銅網(wǎng)清洗，用丙酮和乙 醇浸洗 2、支持膜制備：常用Formvar膜聚乙烯醇縮 甲醛），由氯仿配置，濃度為0.5%。 3、玻璃刀制備：專用制刀機(jī)制作。 4、半薄切片光鏡定位。 5、修塊技術(shù)。 6、超薄切片厚度在 5080 nm 之間較為合 適，干涉色為金黃色為宜。 7、撈片：常用粘撈法和圈撈法。超薄切片機(jī) 分兩類： 一類是機(jī)械推進(jìn)式切片機(jī)，用微動螺旋和微動杠桿來提供微小推進(jìn)； 另一類是熱脹冷縮式切片機(jī)，利用金屬桿熱脹或冷縮時(shí)產(chǎn)生的微小

16、長度變化來提供推進(jìn)。 切片染色： 生物材料是由氫、碳、氮、氧、磷等具有很小原子序數(shù)的物質(zhì)組成，這些物質(zhì)對電子透射能力和散射能力基本一樣，這樣所產(chǎn)生圖象的反差是很弱的。 采用重金屬處理以增強(qiáng)反差、提高分辯率。由于被染色標(biāo)本的不同結(jié)構(gòu)成份對重金屬的結(jié)合量不同，染色處理后重金屬密度高的部分因散射掉的電子較多，在熒光屏上觀察顏色也就較深，這樣可獲得反差對比良好的圖象。 常用的重金屬為鉛和鈾。 電鏡觀察、拍片、記錄等。 首先，觀察人員要熟悉電鏡的基本操作程序以及所要觀察材料的相關(guān)知識。 其次，做好觀察記錄，選好范圍拍片，準(zhǔn)確記錄底片號碼及相應(yīng)內(nèi)容。 最后，做好各種資料的整理、備案工作。 負(fù)染技術(shù)的原理：

17、 觀察顆粒狀生物材料的外部形狀常用的染色方法。 用重金屬鹽沉積到樣品四周，樣品四周散射電子的能力就較強(qiáng)，因而表現(xiàn)為暗區(qū)；樣品本身散射電子的能力較弱，則表現(xiàn)為亮區(qū)，這樣便能把樣品的外形與表面結(jié)構(gòu)清楚地襯托出來。標(biāo)本回顧性研究 石蠟塊做超薄切片技術(shù)1、取材：用鋒利刀片從石蠟塊上切下1mm 左右的厚片， 對照HE切片在切下的厚片上選取所需部位， 切成1mm3 的小塊。2、溶蠟：二甲苯浸泡812h，使石蠟完全溶解，期間 換2次新二甲苯。3、水化：用100%、90%、80%、70%、50%乙醇進(jìn)行 水化，直到完全水化。4、漂洗：用緩沖液漂洗（0.1M磷酸緩沖液或二甲砷酸 鈉緩沖液)后，1%鋨酸后固定12

18、h。5、脫水：50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水。6、浸泡包埋同常規(guī)方法。光 源聚光鏡樣 品物 鏡 投影鏡最終象透射電子顯微鏡 光學(xué)顯微鏡 鏡筒內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖鏡筒內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖： 1) 照明系統(tǒng)： 電子槍 聚光鏡 2） 樣品室 3） 成象系統(tǒng)： 物鏡 中間鏡 投影鏡 4） 觀察記錄系統(tǒng)： 觀察室 照相機(jī) 三、觀察記錄系統(tǒng)1、熒光屏 為圓形平面結(jié)構(gòu)，上面涂以熒光粉，當(dāng)高速電子撞擊其表面時(shí)，便激發(fā)出熒光，從而使觀察者能通過含鉛玻璃窗口直接看到影象。2、照相室 在熒光屏的下邊，裝有電鏡軟片，通過電子束直接轟擊軟片表面而使軟片爆光，從而使觀察影象以底片或照片的形式保存下來。四、真空系統(tǒng) 由低真空和高真空兩極真空泵構(gòu)成。前者稱為機(jī)械泵，排氣氣壓達(dá)0.01mmHg;后者稱為擴(kuò)散泵，排氣氣壓可達(dá)0.0001mmHg以下。 真空系統(tǒng)的作用是使鏡筒內(nèi)部獲得高真空。如果鏡筒內(nèi)真空度較差，將會: 1）氣體分子與高速電子相 互作用，隨機(jī)地散射電子，降低象的反差。 2）電子槍中存在殘余氣體，會產(chǎn)生電離和放電，引起電子束發(fā)射不穩(wěn)定