蛋白質(zhì)工程設(shè)計

1、會計學(xué)1蛋白質(zhì)工程設(shè)計蛋白質(zhì)工程設(shè)計第三節(jié) 天然蛋白質(zhì)的剪裁方法：1、將編碼一種蛋白質(zhì)的部分基因移植到另一種蛋白質(zhì)基因上2、將不同蛋白質(zhì)基因的片段組合在一起，經(jīng)基因克隆和表達(dá)，產(chǎn)生出新的融合蛋白質(zhì)。應(yīng)用 1、嵌合抗體 利用基因工程的方法對鼠源單克隆抗體進行改造使其人源化，鼠源抗體的V區(qū)與人源抗體的C區(qū)進行拼接形成人-鼠嵌合抗體。 特點：減少了鼠源性抗體的免疫原型； 保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。2、人改型抗體 將鼠單抗的CDR移植到人單抗的骨架區(qū)。結(jié)構(gòu)與功能的容忍度 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能對殘基的替換有一定的容忍度，即結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系有一定的穩(wěn)健度 Fersht等替換了Barnase的所有內(nèi)核殘

2、基。結(jié)果表明23的突變體保留了酶的活性 Mathews及其合作者在溶菌酶內(nèi)核中替換多至10個殘基。實驗證明多重取代的蛋白仍具有活性以及協(xié)同折疊 這些結(jié)果說明不同的氨基序列具有相近的設(shè)計的結(jié)構(gòu)第四節(jié) 蛋白質(zhì)分子的全新設(shè)計 全新蛋白質(zhì)設(shè)計：指基于對蛋白質(zhì)折疊規(guī)律的認(rèn)識，從氨基酸的序列出發(fā)，設(shè)計制造自然界不存在的全新蛋白質(zhì)使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期的功能。蛋白質(zhì)全新設(shè)計流程設(shè)計目標(biāo)序列生成結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)構(gòu)模型基因克隆、多肽合成全新蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)功能預(yù)測蛋白質(zhì)的全新設(shè)計內(nèi)容：1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計-二級結(jié)構(gòu)2）蛋白質(zhì)功能的從頭設(shè)計-天然蛋白質(zhì)功能的模擬 根據(jù)穩(wěn)定不同類型蛋白質(zhì)的相互作用力來設(shè)計不同類

3、型的蛋白質(zhì)，且已取得了明顯進展，例如，離子通道納米管、血紅素結(jié)合蛋白、 氧化還原活性蛋白質(zhì)、DNA結(jié)合蛋白及基于蛋白質(zhì)的高分子材料。一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計螺旋是通過氫鍵達(dá)到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的，單一螺旋在溶液中是穩(wěn)定的。螺旋設(shè)計使用的策略有：1）使用大的形成螺旋傾向性的殘基，如亮氨酸、谷氨酸或賴氨酸等2）使用合適的集團去除端基電荷，防止與螺旋偶極不合適的電荷相互作用3）使用極化或荷電氨基酸引入穩(wěn)定的氫鍵或在螺旋中相隔一圈殘基間的離子相互作用4）使用在螺旋中相隔一圈的殘基間疏水的（脂肪的或芳香的）范德華相互作用5）使用芳香-荷電或芳香-硫的相互作用螺旋：1、二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝 最簡單、最直接的策略

4、：合成單一二級結(jié)構(gòu)單元（螺旋或折疊股）作為多肽鏈的片段模塊途徑，復(fù)制這些二級結(jié)構(gòu)片段并把它們連接為整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。優(yōu)點：無論是從設(shè)計或合成看，都是簡單的；容易合成缺點：蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（熵較大，依賴濃度）；結(jié)構(gòu)的簡單重復(fù)+兩條肽鏈自組裝為有序的二聚體結(jié)構(gòu) 螺旋 最簡單的在自然界觀察得到的螺旋結(jié)構(gòu)是coiled-coil以及四螺旋束。coiled-coil：Hodges及其合作者設(shè)計（周期性重復(fù)七肽）（a）（b）（c）DeGrado及其合作者通過逐漸增長的方法設(shè)計、合成的四螺旋束蛋白質(zhì)（a）16個殘基的肽形成二聚體（b）32個殘基的肽形成的四螺旋束（c）通過分子內(nèi)折疊形成的74殘基的蛋白質(zhì)四螺旋束

5、coiled-coil和螺旋束差別：共同之處：均為兩親性螺旋不同點：coiled-coil含有一個狹窄的疏水面（疏水殘基主要在7肽序列a和d位置），而螺旋束含有較寬的疏水面2、配體誘導(dǎo)組裝 使用一個配體（典型的是一個金屬離子）誘導(dǎo)模塊蛋白片段的組裝。 配體誘導(dǎo)組裝3通過共價交叉連接實現(xiàn)肽的自組裝 設(shè)計全新蛋白的主要障礙是肽鏈的構(gòu)象熵。當(dāng)幾個沒有連接的肽鏈進行自助裝時，熵勢壘比較難以克服。通過共價交叉連接可以減少構(gòu)象熵。 被共價交叉連接所穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)的組裝 在自然界中唯一用于交叉連接的方法是二硫鍵。在全新蛋白設(shè)計中也使用其他種類的交叉連接。例如Betabellin的設(shè)計中使用的DAB交叉連接方法，

6、雖然DAB是二價的，但是DAB是非極性的，它會減少Betabellin在溶液中的溶解度，為此，二硫鍵連接代替DAB的交叉連接，得到Betabellin14D。在合成模板上肽的組裝 是一種模板組裝合成蛋白方法，不使用天然蛋白中的turn和loops連接二級結(jié)構(gòu)單元，而是使用人工模板。同天然線性蛋白質(zhì)不同，螺旋和折疊股在一個特殊折疊過程有一個正確的相對取向。 Mutter研究組使用的模板是寡肽，可形成兩個反平行折疊股，通過一個在一端的Pro-Gly轉(zhuǎn)折和一個在另一端的二硫鍵形成兩個反平行的折疊股，在鏈的兩端設(shè)計一個二硫鍵，形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 5、線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu) 不用模板或交叉連接而通過線性

7、多肽折疊成球形的確定的三維結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)設(shè)計追求的目標(biāo)之一。主要障礙：構(gòu)象熵基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計組合庫設(shè)計的核心問題：埋藏疏水部分常用方法：基于極性（P）和非極性（N）氨基酸的 “二元模式”，“二元模式”一方面要 有利于形成二級結(jié)構(gòu)，另一方面又要埋 藏疏水殘基。應(yīng)用：二級結(jié)構(gòu)兩親片斷的構(gòu)建（一面完全是極性 殘基，另一面完全是非極性殘基）。 利用組合庫方法尋找全新蛋白質(zhì)已在如下方面取得成功：螺旋；折疊片；單體；自組裝為有序的排列；堆積為天然類蛋白質(zhì)；超熱穩(wěn)定性；結(jié)合輔因子的能力；催化活性。二、蛋白質(zhì)的功能設(shè)計 蛋白質(zhì)設(shè)計的目標(biāo)是產(chǎn)生既能折疊為預(yù)想的結(jié)構(gòu)又具有有趣和有用的功能。功能設(shè)計主要涉及

8、鍵合及催化，達(dá)到這一目的，可以采用兩條不同的途徑：1、反向?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)與工程底物的契合，改變功能；2、從頭設(shè)計功能蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的功能設(shè)計通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計新的功能鍵合及催化的從頭設(shè)計在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點催化活性蛋白質(zhì)的設(shè)計 膜蛋白及離子通道的設(shè)計 新材料的設(shè)計 通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計新的功能 執(zhí)行特別生物功能的天然蛋白質(zhì)能通過反向擬合獲得新的活性。通過修飾天然結(jié)構(gòu)得到專一性及活性改變的天然蛋白質(zhì)是可能的，目前在以下范圍已取得成功：DNA結(jié)合專一性；改變輔因子的專一性；改變底物的專一性。 反向擬合的能力大于僅僅改變專一性的修飾。事實上，它能把新奇的性質(zhì)附加到原蛋白質(zhì)骨架的結(jié)構(gòu)上

9、。實例有：1）引入金屬結(jié)合位點2）位點專一DNA裂解鍵合及催化的從頭設(shè)計(A) 23個氨基酸自動折疊成的鋅指結(jié)構(gòu)（5）的核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)(Struthers et al., 1996, 1998)；(B) 5同源四聚體衍生物T2的X-射線結(jié)構(gòu)（Ali et al., 2004)；(C) T2異源四聚體衍生物hetT1的X-射線結(jié)構(gòu) (Ali et al., 2005).結(jié)構(gòu)域替換寡聚化策略異源專一性的計算機重新設(shè)計型異源四聚體的設(shè)計歷程 在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點 全新蛋白質(zhì)設(shè)計除了能折疊為預(yù)想的結(jié)構(gòu)外，還要設(shè)計新的結(jié)合位點（金屬位點、血紅素結(jié)合位點等）及催化性質(zhì)。新的金屬結(jié)合位點催化活

10、性蛋白質(zhì)的設(shè)計 這類設(shè)計的早期代表性工作是Chymohelizyme及Helichrome。兩個設(shè)計蛋白質(zhì)的催化位點與天然酶類似，在Chymohelizyme中設(shè)計的活性位點，是模擬胰凝乳蛋白酶在Helichrome中的卟啉環(huán)類似于血紅素蛋白的活性位點。兩個設(shè)計均使用人工交叉連接預(yù)組織結(jié)構(gòu)并使活性口袋的位置接近催化活性部分。后來又設(shè)計了人工脫羧酶（ART-OAD） 放置一個賴氨酸在兩親螺旋極面上并非常接近其他賴氨酸鏈，使中心的賴氨酸作親核試劑，支架上的賴氨酸是荷正電能與荷負(fù)電的底物成鍵。CD譜以及NMR譜研究表明，螺旋占優(yōu)勢。它的二級結(jié)構(gòu)依賴于濃度，表明兩親螺旋的組裝體為期望的多聚體（可能是四

11、聚體）。它的Km（14mmol/L)類似于天然酶（Km=4mmol/L)。合成肽的Kcat（0.4min）比天然酶慢5個數(shù)量級但仍比脫羧反應(yīng)快900倍。5、膜蛋白及離子通道的設(shè)計 一個全新膜蛋白從一個不溶于水的聚集體轉(zhuǎn)化為類似于膜的環(huán)境要求構(gòu)象變化。 Montal等設(shè)計了一系列模擬天然離子通道特征的全新蛋白質(zhì)，這些合成的微孔蛋白質(zhì)稱為Synporin，是使用Mntter的模板模擬方法。4條相同的23肽螺旋被固定在載體模板上，并且相互平行。Synporin結(jié)構(gòu) CD譜研究結(jié)果表明，101個殘基的Synporin主要是螺旋。形成的離子通道具有如下特點：單通道；能區(qū)別不同的陽離子；在毫秒時間范圍內(nèi)打

12、開與關(guān)閉；對局部麻醉通道阻塞劑是敏感的。Lear等設(shè)計并合成了含有簡單兩親螺旋的離子通道，其具有的特點是：序列與天然離子通道序列不同；不用模板，是通過自組裝形成圍繞一個中心親水孔的多聚體。6、新材料的設(shè)計 自組裝是構(gòu)筑新材料的重要方法，是材料科學(xué)與蛋白質(zhì)折疊的共同的課題。Ghadiri等設(shè)計并利用了多肽模塊自組裝成中空納米管的新材料，采取的是平面環(huán)形構(gòu)象。在中性情況下，谷氨酸側(cè)鏈荷負(fù)電，同時環(huán)肽彼此排斥，但在酸性情況下，酸性基團質(zhì)子化并形成平面分子間的氫鍵，替代了環(huán)肽間的排斥。因此介質(zhì)的酸化導(dǎo)致環(huán)肽的自組裝。2、人改型抗體 將鼠單抗的CDR移植到人單抗的骨架區(qū)。 螺旋 最簡單的在自然界觀察得到的螺旋結(jié)構(gòu)是coiled-coil以及四螺旋束。coiled-coil：Hodges及其合作者設(shè)計（周期性重復(fù)七肽）（a）（b）（c）DeGrado及其合作者通過逐漸增長的方法設(shè)計、合成的四螺旋束蛋白質(zhì)（a）16個殘基的肽形成二聚體（b）32個殘基的肽形成的四螺旋束（c）通過分子內(nèi)折疊形成的74殘