蛋白質(zhì)及氨基酸的測定

1、會計學1蛋白質(zhì)及氨基酸的測定蛋白質(zhì)及氨基酸的測定 由19世紀丹麥化學家Kieldahl首先提出。 它是測定蛋白質(zhì)最常用的方法，也是測定總有機氮最準確和操作簡單的方法之一。 適用范圍：此法只限于測定總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，可得蛋白質(zhì)含量，由于樣品中常含有非蛋白質(zhì)的含氮化合物，因此常將測定的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法A、凱氏燒瓶規(guī)格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml特點：瓶頸長、耐高溫B、常量凱氏定氮裝置實驗原理實驗原理 蛋白質(zhì)在強堿性溶液中與稀硫酸銅作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)，生產(chǎn)紫紅色配合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，因此也能發(fā)生上述

2、反應(yīng)，生成紫紅色配合物。優(yōu)缺點優(yōu)缺點 不受溫度影響，但靈敏度低儀器：分光光度計；離心機試劑：堿性硫酸銅溶液；四氯化碳讀數(shù)時要注意讀的是A的值；注意正確標記試管（用記號筆清晰標記于試管2/3高處）；準確記時。注意事項注意事項紫外分光光度計法.將透明液置于比色皿中，以8mol/L尿素的2mol/L氫氧化鈉溶液作參比液，在280nm波長處測定各溶液的吸光度值A(chǔ)。以凱式定氮法測得樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量為橫坐標，上述吸光度值A(chǔ)為縱坐標，繪制標準曲線。 蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生成鉬藍和鎢藍化合物），藍色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可用比色

3、法測定。實驗原理實驗原理 吸取一定量的樣品稀釋液，加入福林酚試劑甲3.00ml，置于25中水浴保溫10min，再加入福利-酚試劑乙0.3ml，立即混勻，保溫30min，以介質(zhì)溶液調(diào)零，于750nm波長下測定溶液的吸光度A，與蛋白質(zhì)標準液作對照，求出樣品的蛋白質(zhì)含量。 本法在060mg/L蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。 福林-酚法的靈敏度比雙縮脲法高100倍，肽鍵顯色效果增強，減少了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差。 該法由于兩步呈色反應(yīng)可以疊加，其靈敏度特別 高，所以適用于20250ug微量蛋白質(zhì)的測定，可檢測的最低蛋白質(zhì)量為福林-酚法試劑配置繁瑣耗時。 酚試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定，由于此實驗的反應(yīng)只在P

4、H=10時才發(fā)生，所以加酚試劑時必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會使顯色程度減弱。說明：說明：測定 吸取樣品稀釋液2ml，加染料試劑2ml,混勻，以介質(zhì)溶液調(diào)零，于620nm波長下測定的吸光度A，與蛋白質(zhì)標準液對照，求出樣品蛋白質(zhì)含量。(3)干擾素物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Tris緩沖液、甘油等均不干擾此測定法。單指示劑甲醛滴定法單指示劑甲醛滴定法優(yōu)點優(yōu)點：簡單易行，快速方便缺點缺點：Pro與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；Tyr含有酚羥基，滴定時會消消耗一些堿使結(jié)果偏高；溶液中有銨則可與甲醛反應(yīng)使結(jié)果偏高。適用范圍適用范圍：用于各

5、類樣品游離AA含量的測定 由于本法采用了0.1%百里酚酞作指示劑，樣液需先用NaOH標準溶液滴定到淡藍色后再加40%中性甲醛，若不中和則會造成測定結(jié)果誤差。原理 由于氨基酸為兩性結(jié)構(gòu)，向AA的溶液中加入甲醛溶液，十七堿性消失，這時可以用標準強堿溶液滴定，后計算出AA的量。試劑40%中性甲醛溶液（用百里酚酞作指示劑，用NaOH將40%甲醛中和至淡藍色）0.1%百里酚酞乙醇溶液0.1mol/LNaOH標準溶液測定 1、吸取待測液50mL于250mL錐形瓶中，加 0.1%百里酚酞指示劑23滴 2、用0.1mol/LNaOH標準溶液滴定到淡藍色，再加40%中性甲醛溶液20mL 3、搖勻靜止1min,繼

6、續(xù)用0.1mol/LNaOH標準溶液滴定至淡藍色，記錄第二次滴定所消耗的NaOH溶液的體積V.雙指示劑甲醛滴定法雙指示劑甲醛滴定法原理原理 氨基酸具有酸性的COOH基和堿性的NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當加入甲醛溶液時，NH2與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強堿標準溶液來滴定COOH基，并用間接的方法測定氨基酸總量。試劑試劑 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍色。 百里酚酞乙醇溶液：1g/L。 中性紅50%乙醇溶液：1g/L。氫氧化鈉標準溶液：0.1mol/L操作方法操作方法 移取含氨基酸約2030mg的樣品溶液兩份，分別置于

7、250mL錐形瓶中，各加50mL蒸餾水，其中一份加入3滴中性紅指示劑，用0.1mol/LNaOH標準溶液滴定至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點；另一份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20mL，搖勻，靜置1min，用0.1mol/LNaOH標準溶液滴定至淡藍色為終點。分別記錄兩次所消耗的堿液體（mL）。結(jié)果計算結(jié)果計算式中 X-氨基酸態(tài)氮的含量，g/100g； c -氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L； V1-用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，mL； V2-用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，mL； m-測定用樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量，g； 0.014-氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmo

8、L。100014. 0)(12mcVVX電位滴定法電位滴定法(1) 原理原理 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標準溶液滴定，依據(jù)酸度計指示的pH值判斷和控制滴定終點。(2) 酚酞乙醇指示液：1%硼砂（標準物質(zhì)）緩沖液：PH9.22 稱取3.8克Na2B4O7 溶解后，定容至1000mL中性甲醛溶液：%氫氧化鈉標準溶液：0.0500mol/(4) (4) 試驗步驟試驗步驟 吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0mL置于200mL燒杯中，加水60mL，

9、開動磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2（記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標準溶液的毫升數(shù)，可計算總酸含量）。 加入10.0mL甲醛溶液，混勻。再用0.05mol/L氫氧化鈉標準的溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標準溶液的毫升數(shù)。 同時取80mL蒸餾水置于另一200mL潔凈燒杯中，先用0.05mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定至pH9.2，做試劑空白試驗。操作方法標準曲線的繪制準確吸取200ug/ml的氨基酸標準溶液0.0ml、0.5ml、1.0m

10、l、1.5ml等，分別置于25ml比色管中，個加水至容積為4.0ml，然后加入2%茚三銅溶液和pH為8.04的磷酸鹽緩沖液各1ml，混合均勻后于水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，定容，搖勻。靜置15min后，在570nm波長下，以試劑空白為參比液測定各溶液的吸光度A値。以氨基酸的微克數(shù)為橫坐標，吸光度A值為縱坐標，繪制標準曲線。注意事項茚三銅受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前需進行純化。試劑1. 1%的氧化鎂混懸液2. 20%的硼酸指示劑測定1、樣品處理2、蒸餾吸收3、滴定結(jié)果計算C-鹽酸標準溶液的濃度，mol/lV1-滴定樣品吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積。M-樣品質(zhì)量，gV0-滴定空白吸收液時消耗鹽酸標準溶液濃度，g/mmol注意事項1、滴定重點的觀察，應(yīng)注