酵母細(xì)胞的收集

1、酵母細(xì)胞的收集酵母細(xì)胞的收集目標(biāo)：從釀酒酵母培養(yǎng)液中收集酵母細(xì)胞。原理：酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶屬于胞內(nèi)酶，所以常將細(xì)胞壁破碎后進(jìn)行提取。本法先采用離心法收集新鮮酵母細(xì)胞，再采用菌體自溶方法來(lái)破碎細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的蔗糖酶釋放出來(lái)。操作方法：酵母細(xì)胞的收集在50ml塑料離心管中裝入45ml新鮮釀酒酵母發(fā)酵液，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，小心移除上清液。再往離心管中加30ml無(wú)菌生理鹽水，震蕩離心管。使酵母細(xì)胞沉淀重新懸浮與液體中，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，小心移除上清液，得到新鮮的釀酒酵母細(xì)胞沉淀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：酵母細(xì)胞沉淀結(jié)果為：0.94g注意點(diǎn)：使用離心機(jī)時(shí)注意平衡問(wèn)題，使用離心管前應(yīng)先

2、稱(chēng)量空離心管質(zhì)量。結(jié)果分析：酵母菌達(dá)不到25g，沒(méi)達(dá)到要求。酵母細(xì)胞的自溶酵母細(xì)胞的自溶目標(biāo)：從釀酒酵母液中收集酵母細(xì)胞，并使之自溶。原理：酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶屬于胞內(nèi)酶，所以常將細(xì)胞壁破碎后進(jìn)行提取。本法先采用離心法收集新鮮酵母細(xì)胞，再采用菌體自溶方法來(lái)破碎細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的蔗糖酶釋放出來(lái)。操作方法：酵母自溶在收集有25g酵母細(xì)胞沉淀的500ml三角瓶中加入醋酸鈉1.6g，攪拌1520分鐘，使團(tuán)塊的鮮酵母液化，加1.5甲苯，用保鮮膜密封瓶口，搖動(dòng)10分鐘使甲苯和酵母液充分混勻，加入37培養(yǎng)箱中保溫60小時(shí)，使酵母自溶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞自溶：破碎細(xì)胞壁細(xì)胞自溶結(jié)果為：35.9g酵母蔗糖酶粗

3、液的制備酵母蔗糖酶粗液的制備目標(biāo)從釀酒酵母細(xì)胞破碎液中制得蔗糖酶被提液A原理釀酒酵母細(xì)胞破碎后，經(jīng)過(guò)細(xì)胞碎片分離提取蔗糖酶液，再經(jīng)熱提取和乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提純操作方法在培養(yǎng)物中取出裝有已自溶酵母的三角瓶，加30ml蒸餾水，搖勻，倒入50ml塑料離心管，10000轉(zhuǎn)/分鐘20min,經(jīng)離心后，離心管中的懸浮液分3層，上層為漿狀的固體，下層為固體，中間層為液體，小心仔細(xì)取出中間層液體，重新倒入離心管中10000轉(zhuǎn)/分鐘離心20min,仔細(xì)取出上清液并用量筒測(cè)出體積記為VA，取出3ml保存（做好標(biāo)記），用等以后的活力和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，所提取的液體為初提取液A實(shí)驗(yàn)結(jié)果：蔗糖酶初體液A

4、為11.2ml 注意事項(xiàng)：要注意離心管的重要配平蔗糖酶的提取及初提純蔗糖酶的提取及初提純目標(biāo)從釀酒酵母細(xì)胞破碎液中制得蔗糖酶初提液A、熱提取液B和乙醇沉淀提取液C。原理釀酒酵母細(xì)胞破碎后，經(jīng)過(guò)細(xì)胞碎片分離提取蔗糖酶液，再經(jīng)熱提取和乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提純。操作方法操作方法熱提取液熱提取液B 將初提液將初提液A倒入倒入50ml三角瓶中，加三角瓶中，加3.2ml 4N醋酸，使溶液的醋酸，使溶液的pH值約為值約為4.5左右，搖勻，迅速在水浴中加熱至左右，搖勻，迅速在水浴中加熱至50，保溫，保溫30分鐘分鐘（注意溫度絕對(duì)不能超過(guò)（注意溫度絕對(duì)不能超過(guò)50），在保溫的過(guò)程中不斷搖動(dòng)三角瓶，）

5、，在保溫的過(guò)程中不斷搖動(dòng)三角瓶，取出后迅速在冰浴中冷卻，冷卻液在離心機(jī)中取出后迅速在冰浴中冷卻，冷卻液在離心機(jī)中10000 rpm離心離心15分分鐘，仔細(xì)地取出上清液并用量筒測(cè)出體積記為鐘，仔細(xì)地取出上清液并用量筒測(cè)出體積記為VB，此提取液為熱，此提取液為熱提取液提取液B，取出，取出3毫升保存（做好標(biāo)記），用于以后的活力和蛋白毫升保存（做好標(biāo)記），用于以后的活力和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。質(zhì)含量的測(cè)定。乙醇沉淀提取液乙醇沉淀提取液C 將熱提取液將熱提取液B倒入倒入100毫升燒杯中，把燒杯放入冰浴中毫升燒杯中，把燒杯放入冰浴中，輕輕輕輕攪拌并慢慢加入（攪拌并慢慢加入（-20）95%乙醇溶液，體積與熱提取

6、液乙醇溶液，體積與熱提取液B相同。相同。整個(gè)過(guò)程不少于整個(gè)過(guò)程不少于30min，再繼續(xù)攪拌，再繼續(xù)攪拌10min，將燒杯內(nèi)的液體全部，將燒杯內(nèi)的液體全部移入離心管中（白色固體保留待用），移入離心管中（白色固體保留待用），15000 rpm離心離心10min。離。離心后，仔細(xì)地倒掉上層清液，用心后，仔細(xì)地倒掉上層清液，用5ml 0.05M Tris-HCl（pH7.3）緩）緩沖液把燒杯中的白色粘狀固體溶解，倒入離心管攪拌使離心管內(nèi)的沖液把燒杯中的白色粘狀固體溶解，倒入離心管攪拌使離心管內(nèi)的白色固體溶解，白色固體溶解，15000rpm離心離心10min，取上層清液即為乙醇沉淀，取上層清液即為乙醇沉

7、淀提取液提取液C，測(cè)量其體積記為，測(cè)量其體積記為VC，取出，取出3ml保存（做好標(biāo)記），用于保存（做好標(biāo)記），用于以后的活力和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。以后的活力和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果蔗糖酶純化的熱提取B為9ml，乙醇提取液C為5.4ml，第二次離心為16.4ml蔗糖酶的純化蔗糖酶的純化Q Sepharose-柱柱層析法層析法目標(biāo)采用離子交換層析法，從乙醇沉淀提取液C中進(jìn)一步純化得到蔗糖酶的柱層析分離組分。原理本法所用的Q Sepharose凝膠是以瓊脂糖作為不溶性母體引入季銨型集團(tuán)，為強(qiáng)陰離子交換劑。Q Sepharose凝膠交換介質(zhì)載量高，分辨率高，能承受較高的流速，化學(xué)穩(wěn)定性好。在pH7左

8、右時(shí)，Q Sepharose凝膠帶正電，而一般蛋白質(zhì)在此pH值范圍帶負(fù)電，兩者可結(jié)合，降低pH或提高離子強(qiáng)度均可使之洗脫下來(lái)，當(dāng)被吸附的蛋白質(zhì)的Kd值有差異時(shí)，達(dá)到分離的目的。操作方法1、離子交換柱的填充 取1支內(nèi)徑1cm、高30cm的層析柱垂直固定，下端的橡皮管用夾子夾緊，先在柱子內(nèi)加入5mL蒸餾水。將已經(jīng)處理好的Q Sepharose凝膠調(diào)成懸浮狀，一次性完全加入層析柱內(nèi)，使Q Sepharose凝膠緩慢均勻地下降至柱的下部，得交換柱高約為10cm，用小玻棒輕輕攪動(dòng)交換劑的最上端使之有一個(gè)平的表面。注意在整個(gè)柱操作過(guò)程中防止液面低于交換劑的表面，當(dāng)液面低于交換劑表面時(shí)空氣將進(jìn)入交換劑內(nèi)，在

9、交換劑內(nèi)形成氣泡，影響分離效果。放松柱下端的夾子，使流動(dòng)相流動(dòng)，至與交換劑表面相距23cm處，夾緊夾子，防止流動(dòng)相繼續(xù)流出，此時(shí)完成交換柱的填充任務(wù)。2、柱的平衡 將柱子與恒流泵相連，放松夾子，打開(kāi)恒流泵，用大于5個(gè)柱體積（CV）的0.05mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液進(jìn)行沖洗。3、加樣 將緩沖液放至剛好與交換劑表面相切，夾緊柱下端的夾子，取0.5 mL乙醇提取液C緩慢地加到交換柱上（加樣不可太快，以免攪渾交換劑表面），放松柱下端的夾子，使樣品剛好全部進(jìn)入交換劑內(nèi)部，夾緊夾子，再加3 mL緩沖液。加樣以后的流出液都要進(jìn)行收集，每管收集3 mL。4、洗脫 將柱子與恒流泵相連，放松

10、夾子，用恒流泵控制流速為3 mL/min，每管收集3 mL，先用0.05mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液25 mL洗穿透峰，接著連接梯度發(fā)生器，進(jìn)行線性梯度洗脫，直到梯度發(fā)生器內(nèi)的緩沖液全部用完為止，再用0.05mol/L Tris-HCl pH7.3緩沖液配制的1 mol/L NaCl溶液25 mL洗脫。5、離子交換柱的再生 用0.5 mol/L NaOH洗3CV，再用水洗5CV。6、測(cè)吸光度 在紫外分光光度計(jì)上測(cè)出每管在280 nm處的紫外吸光度OD值，畫(huà)出管數(shù)與吸光度OD值的關(guān)系曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果蔗糖酶的活力的測(cè)定蔗糖酶的活力的測(cè)定目標(biāo)測(cè)定初提取液A、熱提取液B、乙醇沉淀提取液

11、C和柱分離液D中的蔗糖酶活力，了解各階段的純化情況。原理酶的活力大小通常是以該酶在最適PH、溫度等條件下催化底物水解，經(jīng)一定時(shí)間后，以反應(yīng)物中底物的減少或產(chǎn)物形成的量來(lái)表示的。其原理為，在過(guò)量的堿性溶液中，DNS與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物,該化合物在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收，在一定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測(cè)定樣品中還原糖的量操作方法1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支試管，分別按表1加入各種試劑。將各試管內(nèi)的液體混合均勻，在沸水中加熱5分鐘。取出后立即用冷水冷卻至室溫，于540nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，以葡萄糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)

12、曲線。01234500.751.001.251.501.75蒸餾水3.002.252.001.751.501.253,5-二硝基水楊酸1.501.501.501.501.501.50總體積4.504.504.504.50試管號(hào)4.50葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液2.酶活力的測(cè)定（1）將以往實(shí)驗(yàn)得到的四部分提取液用冷蒸餾水按比例稀釋?zhuān)撼跆崛∫篈（1：200）;熱提取液B（1：200）；乙醇沉淀提取液C（1:200）；柱分離液D（1:20）。（2）取8支試管，按表2加入各種試劑。3、從每管中取出0.5毫升反應(yīng)液（V測(cè)）進(jìn)行還原糖的測(cè)定，方法和1所述相同，如果測(cè)得的OD值不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，則可增加或減少取樣量，直

13、到OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)為止。計(jì)算4.5毫升溶液中所含還原糖的量（以葡萄糖計(jì)算）用表格記錄下來(lái)。4、計(jì)算出酶的活力單位數(shù)蔗糖酶的活力單位定義為：在一定條件下（PH為4.6、溫度為35）在3分鐘內(nèi)能水解蔗糖成還原糖1毫克所需的酶量，成為1個(gè)活力單位?？偦盍挝粩?shù)=式中，mg為V測(cè)體積測(cè)出的葡萄糖的毫克數(shù)；n為酶液稀釋倍數(shù)；V總為各種提取液在提取過(guò)程中得到的總體積。酶的回收率=（各提取液的總酶活/初提液A的總酶活）100%實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)計(jì)算mg=5.999總活力單位數(shù)=5.999/2*4.5/2*3*20 =404.9325蛋白質(zhì)含量測(cè)定及比活力計(jì)算蛋白質(zhì)含量測(cè)定及比活力計(jì)算目標(biāo)測(cè)定初提液A、熱提取液

14、B、乙醇沉淀提取液C和柱分離液D中的總蛋白含量，計(jì)算比活力，了解各階段蔗糖酶的純化倍數(shù) 。原理本法（Folin-Loury）中所用的Folin-酚試劑中的主要成分磷鉬酸、磷鎢酸，可被蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸還原生成藍(lán)色化合物磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)，蛋白質(zhì)濃度增高，產(chǎn)物顏色加深，這一藍(lán)色溶液在750nm和660nm有較強(qiáng)的光吸收能力，故可用比色法測(cè)定已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的OD值，然后據(jù)此測(cè)出未知樣品的蛋白濃度。 本法極為靈敏，樣品中蛋白含量少至5微克即可迅速方便的測(cè)知。缺點(diǎn)是蛋白濃度和光密度線性關(guān)系不夠嚴(yán)格，而且不同的蛋白質(zhì)因酪氨酸和色氨酸含量不同，顯色程度也有差異，然而，這方法對(duì)蛋白質(zhì)含量的一

15、系列變化，如蛋白質(zhì)提純過(guò)程的分析頗為有用。操作方法1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6支試管，從05編號(hào)，按表1分別加入各試劑。試劑A加畢混勻后，靜置10min，再向各管加試劑B 0.3mL后放置10min，再加第二次試劑B 0.2mL，每加一次均應(yīng)立即迅速充分混合（加一管搖一管）。全部加畢后，放置55恒溫器內(nèi)保溫5min或室溫放置30min。 試劑量試劑量/mL所加試劑所加試劑管號(hào)管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白液標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白液/mL00.20.40.60.81.0H2O/mL4.54.34.13.93.73.5試劑試劑A/mL1.01.01.01.01.01.0試劑試劑B/mL第一次第一次0.30.30.30.30.30.3第二次第二次0.20.20.20.20.20.2總體積總體積/mL6.06.06.06.06.06.0取出試管至冷水中冷卻1min。以空白0號(hào)為對(duì)照，在660nm處測(cè)得各管OD值，以牛血清白蛋白微克數(shù)為橫坐標(biāo)，OD660為縱坐標(biāo)，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、未知蛋白濃度的測(cè)定 將以往實(shí)驗(yàn)得到