生物樣品多氯聯(lián)苯分析方法

1、水生態(tài)毒理研究組 環(huán)境樣品中污染物分析方法規(guī)范 1沉積物中多氯聯(lián)苯類化合物分析規(guī)范1. 目標化合物20世紀70年代中期，美國在“清潔水法”中規(guī)定了129種優(yōu)先污染物，其中包括6類PCB Aroclors，屬于多氯聯(lián)苯類化合物，本論文中研究的主要多氯聯(lián)苯目標化合物則選擇其中有代表性的12種同族物，它們分別是：PCB18、28、29、44、52、101、118、138、149、153、180、194（數字均為IUPAC編號）。2. 試劑、器皿和儀器2.1. 試劑二氯甲烷(Dichloromethane)，農殘級（美國Fisher Scientific公司）；甲醇（Methanol），HPLC級（美

2、國Fisher Scientific公司）；正己烷（n-Hexane），農殘級（美國Fisher Scientific公司）；Florisil（即佛羅里達硅土，120目），農殘級（美國SIGMA）；中性氧化鋁（50200目），（美國ACROS ORGANICS）；無水硫酸鈉，優(yōu)級純，經450焙燒12 h后置于密封廣口瓶中保存?zhèn)溆茫?多氯聯(lián)苯標準物質：12種多氯聯(lián)苯同族物組成的混合標樣，購自美國Supelco Co.；內標化合物（I.S.）：五氯硝基苯（PCNB），購自美國Supelco Co；回收率指示物(S.S.)：2，4，5，6-四氯間二甲苯（TMX）和十氯聯(lián)苯（PCB209）購自美國Su

3、pelco Co；(Supelco Co.的材料由北京康林公司購買，業(yè)務電話010-64926155)。剪刀、濾紙、鑷子及藥匙（硅膠柱凈化所用）：以二氯甲烷超聲清洗15min兩次、正己烷超聲清洗15min一次；Florisil在400±2C活化2 h（activate）；待冷卻至室溫時，稱重后裝入大口錐形瓶（250或500mL），加入其重量11%的蒸餾水去活性（deactivate），添加過程中應用滴管逐滴加入，邊加邊用力振搖以防止結塊，并超聲振蕩30 min；放置過夜，平衡后加入正己烷浸沒其表面?zhèn)溆茫ㄒ话阋残璺胖眠^夜），此時的Forisil呈現(xiàn)淺灰色。2.

4、2. 儀器超聲波清洗儀(KQ250D型數控超聲波清洗器)恒溫水浴鍋（中國科工衛(wèi)儀器儀表公司）電子天平(精確到0.0001g，Sartorius AG.Co.,BS1005)冷凍干燥儀(FD-1冷凍干燥機，北京博醫(yī)康公司）旋轉旋蒸儀(Buchi, Vac® 500/rotavapor R-200/Heating bath B-490,Germany)氮吹儀(數控氮吹儀，KL512/5093,康林,北京)蛇形索氏提取器(北京玻璃儀器公司，250 ml)氣相色譜儀：HP6890-63Ni微池電子捕獲檢測器 (GC-µECD)(Agilent Technologies，美國)，使用

5、Agilent ChemStation for GC Systems分析處理數據；毛細色譜柱：HP-5石英毛細管色譜柱：30 m ´ 0.32 mm ID ´ 0.25 mm液膜厚不銹鋼泥抓斗100級超凈工作室；高純氮氣便攜式保溫箱不銹鋼采樣小盒瑪瑙研缽及研杵2.3 玻璃儀器及其它用品專用玻儀：雞心瓶、K.D濃縮器、8ml定量樣品瓶，250ml分液漏斗，層析柱（長35cm，內徑1 cm，帶活塞）、GC自動進樣的樣品瓶。常規(guī)玻儀及其他用品：100ml、50ml、10ml量筒；200ml、100ml、50ml燒杯；500ml、50ml試劑瓶；膠頭滴管、玻璃漏斗、玻璃棒；100m

6、l、50ml三角瓶（帶塞）；坩堝、藥匙、5 ml移液管、微量進樣器、乳膠手套、布手套等。所用玻璃儀器均以10的稀硝酸浸泡過夜，再以重鉻酸鉀洗液潤洗浸泡20min以上，分別用自來水、蒸餾水沖洗干凈，在烘箱中110烘干；GC自動進樣的樣品瓶、標準樣品瓶、層析柱必須用鉻酸洗液浸泡一段時間后再認真沖洗干凈烘干，并在400C高溫烘烤2小時以上。3. 樣品采集與保存現(xiàn)場捕撈生物樣品(魚等)放入溶劑淋洗過的不銹鋼容器，并注明采樣時間、采樣地點、樣品編號、樣品名稱、采樣人姓名等。立即冷凍，放入便攜式保溫箱中帶回實驗室。樣品運回實驗室后保存于冰箱（4）中，密封保存(注意避光)，在存放樣品時，應盡量注意存放在沒有

7、有機氣體干擾的區(qū)域，以免交叉污染。所采樣品在7天內前處理完畢，一個月內分析完畢。4. 樣品制備4.1. 制備冷凍的生物樣品在室溫下融化后，用干凈的不銹鋼小勺攪拌均勻，然后在冷凍干燥儀上冷凍干燥，干燥后的樣品經研磨(研磨后過60目不銹鋼篩)，準確稱取25.00 g沉積物樣品，加入回收率指示物TMX和PCB209(加入濃度根據當地污染程度確定，原則是與樣品中目標污染物濃度相接近)，在平衡24小時后，用濾紙包裹(包裹要嚴實，避免泄漏)。冷凍的生物樣品在室溫下融化后，用干凈的不銹鋼小勺攪拌均勻，然后在冷凍干燥儀上冷凍干燥，干燥后的樣品經研磨(研磨后過60目不銹鋼篩)，準確稱取5.00 g沉積物樣品，加

8、入回收率指示物TMX和PCB209(加入濃度根據當地污染程度確定，原則是與樣品中目標污染物濃度相接近)，用濾紙包裹(包裹要嚴實，避免泄漏)。4.2. 提取將包有樣品的生物樣品放入蛇形索氏提取器中，添加200ml二氯甲烷，在平底燒瓶中加入10片左右底銅片(1cm2)，放在水浴鍋中，水浴鍋溫度控制在57-590C，回流速度控制在5-6次/h，連續(xù)抽提72hrs。在提取結束后，將蛇形管中的溶劑盡量完整的導入平底燒瓶中，作好編號。將包有樣品的生物樣品放入蛇形索氏提取器中，添加200ml丙酮：正己烷1：1試劑，在索氏提取器中加入10片左右底銅片(1cm2)，放在水浴鍋中，水浴鍋溫度控制在57-590C，

9、連續(xù)抽提24hrs。在提取結束后，將蛇形管中的溶劑盡量完整的導入平底燒瓶中，作好編號。5. 樣品凈化5.1. 脫脂將提取液在旋轉蒸發(fā)儀上(旋轉過程中注意蒸發(fā)速度，溫度390C,真空度500)，濃縮至約5 ml，使用15ml正己烷定量轉移到50 ml雞心瓶中，使用10 ml濃硫酸(分三次)脫脂（濃硫酸在底層，使用滴管將上清夜轉移到另一雞心瓶中）；繼續(xù)濃縮至1ml左右，加入10ml正已烷，再次濃縮至1ml，完成溶劑替換。將提取液在旋轉蒸發(fā)儀上(旋轉過程中注意蒸發(fā)速度，溫度390C,真空度500)，濃縮至約20 ml，使用5ml濃硫酸脫脂（濃硫酸在底層，使用滴管將上清夜轉移到另一個比色管中，再使用5

10、ml濃硫酸脫脂，上清液轉移至另一雞心瓶（250ml）中,；繼續(xù)濃縮至1ml左右，完成溶劑替換。上樣時直接上樣，再加2-3ml溶劑潤洗，潤洗液也上柱。5.2. 凈化 采用Florisil層析柱凈化。采用濕法裝柱法，在干凈的50cm長內徑為10mm的層析柱上用記號筆在19cm處做上記號，取一個干凈漏斗置于層析管頂端。先用10mL正己烷淋洗層析管，從下端排出至液面剛好浸沒石英砂層，此淋洗液廢棄。關上開關后，再加入20mL正己烷，用濕法裝柱，用藥匙將10 g Florisil從頂端漏斗加入（Florisil層的上界面在19cm的記號線位置）。注意在裝柱過程中，要不斷地加入正己烷以免其黏附在管壁上，并保

11、持正己烷以適當的流速不斷地流出，且保證正己烷液面始終高于柱界面（即柱子不能斷裂）；同時不斷地用吸耳球輕輕敲打滴定管，使Florisil層緊密。最后以同樣方法再在Florisil層上裝入1cm的無水硫酸鈉，用于樣品脫水。調節(jié)正己烷液面，使其正好處于無水硫酸鈉層面之上，關閉開關備用（注意此時管壁上不得粘有固體顆粒，否則需用正己烷沖洗干凈再調節(jié)液面）。整個裝柱過程中，正己烷可回收循環(huán)使用。將1mL待凈化濃縮樣品用滴管移入凈化柱中，浸泡5 min以上，保證樣品與凈化柱充分接觸交換。洗脫：以15mL正己烷分三次洗滌盛有二氯甲烷樣品的K-D濃縮器，均用滴管移入凈化柱中，然后以90滴/min左右的流速流出，

12、并繼續(xù)添加正己烷，使洗脫溶劑總體積為100mL，直至流干，洗脫液用250mL平底燒瓶收集。 5.3. 待測樣制備正己烷洗脫液繼續(xù)濃縮至2 ml，加入內標(PCNB)，用柔和的氮氣吹蒸定容至0.2 ml，作為儀器分析待測樣。待測液定容后轉移至GC自動進樣用的樣品瓶中，用壓蓋器密封后存放于冰箱中待測。凈化采用Florisil層析柱凈化。采用濕法裝柱法，在干凈的50cm長內徑為10.5mm的層析柱上用記號筆在17cm處做上記號，取一個干凈漏斗置于層析管頂端。先用10mL正己烷淋洗層析管，從下端排出至液面剛好浸沒石英砂層，此淋洗液廢棄。關上開關后，用濕法裝柱，用藥匙將10 g Florisil從頂端漏

13、斗加入（Florisil層的上界面在17cm的記號線位置）。注意在裝柱過程中，要不斷地加入正己烷以免其黏附在管壁上，并保持正己烷以適當的流速不斷地流出，且保證正己烷液面始終高于柱界面（即柱子不能斷裂）；同時不斷地用吸耳球輕輕敲打滴定管，使Florisil層緊密。最后以同樣方法再在Florisil層上裝入1cm的無水硫酸鈉，用于樣品脫水。調節(jié)正己烷液面，使其正好處于無水硫酸鈉層面之上，關閉開關備用（注意此時管壁上不得粘有固體顆粒，否則需用正己烷沖洗干凈再調節(jié)液面）。整個裝柱過程中，正己烷可回收循環(huán)使用。將1mL待凈化濃縮樣品用滴管移入凈化柱中，浸泡5 min以上，保證樣品與凈化柱充分接觸交換。洗

14、脫：以15mL正己烷分三次洗滌盛有二氯甲烷樣品的K-D濃縮器，均用滴管移入凈化柱中，然后以90滴/min左右的流速流出，并繼續(xù)添加正己烷，使洗脫溶劑總體積為100mL，直至流干，洗脫液用250mL平底燒瓶收集。 5.4. 待測樣制備收集液濃縮后轉移至KD濃縮管，用柔和的氮氣吹蒸定容至0.2 ml，作為儀器分析待測樣。待測液定容后轉移至GC自動進樣用的樣品瓶中，用壓蓋器密封后存放于冰箱中待測。6. 分析測定方法6.1. 色譜條件HP-5石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25m）；檢測器放射源為63Ni；進樣口溫度：280；檢測器溫度：300；載氣：高純氮氣，恒流2.5m

15、L/min；無分流進樣1L。升溫程序為：始溫60保留2 min，15/min升至180保留10 min，再以4/min升至250。6.2. 定性與定量目標化合物定性利用多氯聯(lián)苯混合標樣6次平行分析的平均保留時間對照各色譜峰保留時間對實際樣品中的農藥進行定性(標準樣品色譜圖見圖1)。樣品中有機氯農藥的含量用內標峰面積法定量。7. 質量保證與控制(QA/QC)體系7.1. 質量保證/質量控制目標：7.1.1. QA: Quality Assurance, 準確性、精密性、可比性7.1.2. QC: Quality Control, 較高的可靠性7.1.3. MDL:在99%以上的置信度，某物質可被

16、可檢出和報告的最低濃度。應至少分析3個以上的含預計方法限濃度3-5倍的目標化合物的攙混樣品獲得MDL7.2. 質量保證/質量控制體系要求：7.2.1. 質量控制樣品：空白樣品，空白加標樣，基質加標樣，重復樣(每20個測試樣品同時完成一組質量控制樣品的測試)。7.2.2. 目標化合物回收率：通過空白加標樣品的測定，得到目標化合物的回收率。7.2.3. 儀器檢測限(IDL)：測定空白樣品(n=6)的5倍最小噪音(noise), 儀器檢測限(IDL)等于3.36乘以5倍最小噪音的標準偏差(n=6),驗證儀器狀態(tài)。7.2.4. 方法檢測限(MDL):基質加標樣(n=6)測定，根據U.S.EPA方法檢測限測定公式計算出本實驗流程(方法)對各種目標化合物的檢測限，判斷本實驗方法對實際樣品中目標化合物檢測數據的可信度。7.2.5. 校正曲線：內標(I.S)定量法. 多點校正(n=6),要求RRF的RSD%<25%。7.2.6. 工作曲線：用新配制的標樣，測定值與已知值(校正曲線)<20%.8. 備注8.1. 在整個樣品制備過程中避免樣品的污染；8.2. 第一次進行多氯聯(lián)苯測定人員必須經過有經驗人員培訓之后方