細胞生物學試驗篇

1、實驗篇實驗一 細胞的形態(tài)觀察及其大小測量【實驗目的】1、通過對原核和真核各種形態(tài)細胞的光學顯微鏡觀察，了解細胞的形態(tài)及其顯微結構；2、學習顯微測量的方法，對細胞的大小有一直觀認識?！緦嶒炗闷贰科胀ü鈱W顯微鏡;目鏡測微尺;鏡臺測微尺;載玻片;蓋玻片等。【實驗材料】小白鼠肝細胞切片;雞血紅細胞;蠶豆葉片橫切片;洋蔥。【實驗內(nèi)容和方法】(一)細胞形態(tài)觀察l、動物細胞的觀察（1）人肝細胞切片：在顯微鏡下仔細觀察肝細胞的形態(tài)構造。注意肝細胞之間的界限、細胞的形狀、細胞核的形狀和數(shù)量、核仁的形狀和數(shù)量、細胞質的形態(tài)構造以及細胞質和細胞核染色的區(qū)別。（2）雞血細胞涂片的觀察：注意觀察血細胞的組成；紅細胞、白

2、細胞、血小板的形態(tài)特點。2、植物細胞的觀察（1）取蠶豆葉片橫切片的觀察：注意表皮細胞和葉肉細胞的基本結構。（2）洋蔥表皮細胞的形態(tài)觀察：用鑷子撕取洋蔥表皮，滴一滴蒸餾水，蓋上蓋玻片。在顯微鏡下觀察的形態(tài)和結構。（二）細胞的大小和測量1、測微尺的使用目鏡測微尺是一塊圓形玻片，中心刻有一尺，長510mm，分成50100格。每格的實際長度因不同物鏡的放大率和不同鏡筒長度而異。鏡臺測微尺是在一塊載玻片中央，用樹膠封固一圓形的測微尺，長1mm或2mm，分成100格或200格，每格的實際長度0.01mm(10m)。當用目鏡測微尺來測量細胞的大小時，必須先用鏡臺測微尺核實目鏡測微尺每一格的長度。方法如下：(

3、1)卸下目鏡的上透鏡，將目鏡測微尺刻度向下裝在目鏡的焦平面上，再旋上目鏡的上透鏡。(2)將鏡臺測微尺刻度向上放在鏡臺上夾好，使測微尺分度位于視野中央。調焦至能看清鏡臺測微尺的分度。(3)小心移動鏡臺測微尺和轉動目鏡測微尺(如目鏡測微尺分度模糊，可轉動目鏡上透鏡進行調焦)，使兩尺左邊的一直線重合，然后由左向右找出兩尺另一次重合的直線(如圖所示)。(4)記錄兩條重合線間目鏡測微尺和鏡臺測微尺的格數(shù)。按下式計算目鏡測微尺每格等于多少m： 0123測定目鏡測微尺每格實長的圖解上尺：目鏡測微尺；下尺：鏡臺測微尺鏡臺測微尺的格數(shù) 目鏡測微尺每格的微米數(shù)= ×10 目鏡測微尺的格數(shù)例如，圖中鏡臺測

4、微尺1格=目鏡測微尺6格，代入公式得：目鏡測微尺每格=16×10m=1.66m (5)取下鏡臺測微尺，換上需要測量的玻片標本，用目鏡測微尺測量標本。2、計算：根據(jù)測量結果計算各種細胞及細胞核的體積。橢球形：V=4ab23 a-長半徑 b-短半徑圓球形：V=43r3 r-半徑圓柱形：V=r2h r-半徑 h-高【作業(yè)與思考】1、血細胞分為哪幾大類？分別描述你看到的不同血細胞的形態(tài)，并闡述其功能。繪圖。2、任意選擇你所看到的動物細胞和植物細胞各一個，繪圖并進行適當標注，測量其大小，并比較動植物細胞大小的差異。3、在不同的放大倍數(shù)下，所測得的細胞大小一致嗎？你認為在哪個放大倍數(shù)下測定得比較

5、準確？為什么？實驗二 PAS（Periodic Acid Schiff）反應顯示糖原和其它多糖物質【實驗目的】1、熟悉PAS法原理及操作步驟；2、觀察PAS反應的染色結果，并觀察多糖在組織細胞中的分布?！緦嶒炘怼慷嗵?polysaccharide)是由多個單糖分子縮合脫水而生成的化合物。廣泛分布于動、植物界。一些不溶性的多糖構成植物和動物的骨架，如植物的纖維素和動物的甲殼素，一般稱為結構多糖。另一些多糖在生物體內(nèi)作為能量貯存，如淀粉（植物）和糖元（動物），在需要時可以通過生物體內(nèi)酶系統(tǒng)的作用分解，釋放出單糖。還有許多多糖具有更復雜多樣的生理功能，如粘多糖、血型物質等，它們在生物體內(nèi)起著重要的

6、作用。淀粉和糖原均由D葡萄糖的分支或直鏈組成，過碘酸是一種強氧化劑，能將葡萄糖中的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成兩個游離的醛基(-GHO)，游離醛基與Schiff試劑反應生成紫紅色產(chǎn)物?！緦嶒炗闷贰?一)試劑：1、過碘酸酒精溶液：取過碘酸（HIO4·2H2O）0.4g溶于35 m1純酒精中 ，加入5 m1 的0.2M醋酸鈉（醋酸鈉2.72g溶于100 m1蒸餾水中），再加入15ml蒸餾水。溶液配好后保存在04的冰箱內(nèi)，并加黑紙保存，此液如顯黃色即失效。2.Schiff試劑：將0.5 g堿性品紅加入100m1煮沸的蒸餾水中，時時搖蕩玻璃瓶或者攪拌，煮5min，使之充分溶解；然后冷

7、卻至50時過濾到具有玻塞的棕色試劑瓶，加入10ml的lmolL的HCl，冷卻至25時加入0.5g偏重亞硫酸鈉，在室溫黑暗條件下靜置24h，其顏色呈褐色或淡黃色，加活性炭0.5g劇烈振蕩搖勻1min；過濾，濾液為無色。置棕色瓶密封，外包黑紙，4保存。本試劑可提前一天準備，此液必需保持清澈透明、無色也無沉淀，容器要小，裝滿后僅留很小的空隙，其中不應有任何氧化劑，不要過長時間暴露在空氣中。如有白色沉淀就不能再用，如顏色變紅可以加入少許偏重亞硫酸鈉，使其再轉變?yōu)闊o色就可以再用。3、亞硫酸水溶液：取10偏重亞硫酸鈉Na2S2O5（或K2S2O5）20ml、1mmolL-1 HCl 20ml和400ml純

8、水混勻即可。此液使用前配制，否則會因SO2逸出失效。（此液中所用的偏重亞硫酸鈉或鉀要與Schiff試劑中所用的相同）：4、蘇木精溶液常用的有5種，其中德拉菲氏蘇木精染液(Delafield 蘇木精染液)配法如下:甲液（蘇木精5g、無水乙醇30ml）乙液（銨礬，即硫酸鋁銨飽和水溶液：比例為1g硫酸鋁：11ml水，用時配110ml,取100ml）丙液（甘油125ml、甲醇125ml）。配法如下：1.將甲液一滴一滴地加入乙液中，并隨時用玻璃棒攪動；2.然后暴露于陽光和空氣中約1周到10天；3.加入丙液；4.將混合液靜置2個月至顏色變深為止（可過濾），此液成熟后須置于陰冷處塞緊瓶口，可長期保存使用，使

9、用時可將染劑1份用35份蒸餾水稀釋，則染色后分化更明顯。、梯度乙醇溶液：100，95，90，80，70，50各兩份。一份用于脫臘復水，一份用于脫水。二甲苯7、100%乙醇+二甲苯（1：1）（二)）用具：載玻片 、蓋玻片、染色缸、顯微鏡 、小燒杯、膠頭滴管、鑷子、刀片 （三）材料：土豆；小鼠肝細胞石蠟切片【實驗步驟】（一）土豆切片的觀察制作土豆徒手切片 過碘酸處理1530min 70%乙醇 1min schiff試劑 15 min 亞硫酸水漂洗23次 蒸餾水漂洗 鏡檢（二）小鼠肝細胞切片的觀察取鼠肝石蠟切片 二甲苯脫蠟約10min 二甲苯+100%乙醇（3 min）梯度乙醇脫二甲苯，在各濃度乙醇

10、（100，95，90，80，70，50）中約23 min 過碘酸 氧化1530 min 蒸餾水漂洗 Schiff試劑1530 min 亞硫酸水漂洗23次 蒸餾水漂洗 蘇木精染色10 min 流水沖洗梯度乙醇脫水（50，70，80，90，95，100），在各乙醇濃度中約23 min 100%乙醇+二甲苯23 min二甲苯適度透明 指甲油封片 鏡檢【作業(yè)與思考】1、 為所觀察到的土豆切片和鼠肝切片繪圖，標注其多糖的位置，并描述這兩種細胞的多糖分布特點。2、影響PAS反應染色效果的關鍵步驟是什么？3、如何制作徒手切片？應注意什么才能得到薄而均勻的切片？鍥而舍之，朽木不折；鍥而不舍，金石可鏤?！咀⒁馐?/p>

11、項】1.過碘酸氧化作用時間稍長，會使反應更加充分。2.Schiff試劑作用時間略長，會使染色效果明顯，但過長將導致染色太深，也不利于觀察。3.二甲苯溶解性很強，時間要把握好，前者以脫蠟為準，不要有空氣，后者以透明為準。如果片子變黑，重新放回二甲苯，再透明一次。4.試劑重復使用后，實驗結果不明顯（脫蠟不完全、染色不好等），因此在實驗中要檢查各試劑是否干凈，如果污染嚴重，一定要更換。實驗三 葉綠體的分離與熒光觀察【實驗目的】1、通過植物細胞葉綠體的分離, 了解細胞器分離的一般原理和方法. 2、觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光, 并熟悉熒光顯微鏡的使用方法. 【實驗原理】 將組織勻漿后懸浮在等滲介質中

12、進行差速離心，是分離細胞器的常用方法。葉綠體的分離應在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)中進行, 以免滲透壓的改變使葉綠體到損傷。將勻漿液1000r/min的條件下離心2min, 以去除其中的組織殘渣和未被破碎的完整細胞。然后，在3000r/min的條件下離心5min，即可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細胞核)。分離過程最好在05的條件下進行，如果在室溫下，要迅速分離和觀察。 某些物質在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就能在極短的時間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就稱為熒光。若停止供能，熒光現(xiàn)象立即停止。有些生

13、物體內(nèi)的物質受激發(fā)光照射后，可直接發(fā)出熒光（稱為自發(fā)熒光），如葉綠素的火紅色熒光。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光（稱為間接熒光），如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)橘紅色熒光。本實驗利用熒光顯微鏡對發(fā)熒光的葉綠體進行觀察。利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光的物質進行檢測時,將受到許多因素的影響,如溫度,光,淬滅劑等。因此在熒光觀察時應抓緊時間, 有必要時立即拍照。另外,在制作熒光顯微標本時最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光油。 【實驗用品】 1.器材： 1）主要設備: 普通離心機,粗天平,熒光顯微鏡；2）小型器材: 剪刀，研缽，移液管，漏斗， 滴管, 10ml刻度離心管,紗布若干, 無

14、熒光載玻片和蓋玻片。鍥而舍之，朽木不折；鍥而不舍，金石可鏤。鍥而舍之，朽木不折；鍥而不舍，金石可鏤。鍥而舍之，朽木不折；鍥而不舍，金石可鏤。2.材料： 新鮮菠菜。 3.試劑： 0.35mol/L氯化鈉溶液,0.01%吖啶橙(acridine orange). 0.01%吖啶橙的配制：稱取0.1g吖啶橙加蒸餾水100ml做干液，貯棕色瓶，置4冰箱保存。放冰箱備用，臨用前取1ml母液加1/15mol/L磷酸緩沖液（pH4.8）9ml稀釋。吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一種熒光色素，其激發(fā)濾光片波長488nm。阻斷濾光片波長515nm。它與細胞中DNA和RNA結合量存在差別，可發(fā)出

15、不同顏色的熒光（即著色特異性），這是由于DNA是個高度聚合物，吸收熒光物質的位置較少，發(fā)綠色熒光，而RNA聚合度低，能和熒光物質結合的位置多，故發(fā)紅色熒光。【實驗方法】 1、葉綠體的分離（1）選取新鮮的菠菜嫩葉，洗凈擦干后，去除葉梗及粗脈并剪碎，稱取2g左右，置于預冷的研缽;（2）加10ml的0.35molL-1 NaCl溶液研磨勻漿;（3）用6層紗布過濾，濾液盛于燒杯中;（4）取濾液4ml于1000rpm離心2min，棄去沉淀;（5）將上清液3000rpm離心5min，棄去上清液，沉淀即為葉綠體（混有部分細胞核）；（6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液懸浮。2、葉綠體的觀察 （1）滴葉

16、綠體懸浮液一滴于載片上，加蓋片；在普通光鏡下觀察，注意觀察所分離的葉綠體的形態(tài)以及其是否完整。（2）滴葉綠體懸浮液一滴于無熒光載片上，加無熒光蓋片；在熒光顯微鏡下觀察葉綠體有無自發(fā)熒光，其顏色如何。（3）滴葉綠體懸浮液一滴在無熒光載片上，再滴加一滴0.01吖啶橙熒光染料，加無熒光蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察其次生熒光。3. 完整細胞中的葉綠體觀察（1）用鑷子撕取一片菠菜葉子表皮，平鋪于載玻片上，滴加一滴提取緩沖液，加蓋片后輕壓，備用。（2）用鑷子撕去菠菜葉子的表皮，用刀片刮下一些葉肉細胞，放于載玻片上，滴加一滴提取緩沖液，加蓋片后輕壓，備用。（3）將以上兩種制片進行一下三種方式的觀察：a在普通

17、光鏡下觀察。b在熒光顯微鏡下觀察。c再滴加一滴0.01吖啶橙熒光染料，加無熒光蓋片后，在熒光顯微鏡下觀察?！咀⒁馐马棥恳玫酵暾摹⒂谢钚缘娜~綠體，須低溫下迅速提取，涂片后立即觀察。【作業(yè)與思考】 1. 描述你所觀察到的實驗現(xiàn)象，自發(fā)熒光和次生熒光的區(qū)別？2葉綠體分離的原理是什么？操作過程中應注意什么？實驗四 吖啶橙(acridine orange)染色 觀察口腔上皮熒光【目的要求】1、熟悉熒光顯微鏡的原理及使用方法。2、觀察熒光染料染色后結合物發(fā)出的熒光。【實驗原理】吖啶橙熒光染料可與細胞內(nèi)DNA和RNA結合。其吸收光譜405nm，發(fā)射的熒光光譜是530640nm，因此，吖啶橙和不同的細胞成

18、分結合后，可發(fā)射紅橙黃綠藍各色熒光?！緦嶒炗闷贰?器材：熒光顯徽鏡、載玻片、蓋玻片、染色缸、牙簽；2材料：口腔黏膜上皮細胞臨時制片；3試劑:1)0.1mol/L pH7.0 PBS液。A液：NaH2PO4·H20 2.76g加蒸餾水至100ml；B液，Na2HPO4·7H20 5.36g加蒸餾水至100ml；取A液16.5ml、B液33.5ml、NaCl 8.5g用蒸餾水稀釋至100ml。2)0.1吖啶橙原液：0.1g吖啶橙加蒸餾水至100ml。臨用時配制0.01吖啶橙染液：將0.1吖啶橙原液用PH7.0 PBS液稀釋。3）95乙醇【方法與步驟】1用牙簽刮取口腔上皮細胞涂在

19、干凈載玻片上；295乙醇溶液固定5min；3滴加0.01吖啶橙染液染色5min；4用PBS緩沖液緩慢沖洗；5加蓋玻片鏡檢?！居^察結果】描述你所觀察到的實驗現(xiàn)象，并繪圖，表明熒光的顏色。實驗五 植物細胞骨架的光學顯微鏡觀察【實驗目的】掌握植物細胞骨架的制備方法，并用光鏡觀察洋蔥內(nèi)皮細胞的骨架網(wǎng)絡結構。 【實驗原理】細胞骨架(cytoskeleton)，是細胞內(nèi)以蛋白質纖維為主要成分的網(wǎng)絡結構，根據(jù)蛋白質纖維的直徑、組成成分和組裝結構的不同可分為微絲、微管和中等纖維。細胞骨架對于維持細胞的形態(tài)結構及細胞運動、物質運輸、能量轉換、信號傳導和細胞分裂等有重要的作用。本實驗采用去垢劑TritonX-10

20、0 的緩沖液處理植物材料時，可將細胞的膜結構和大部分蛋白質抽提掉，但細胞骨架系統(tǒng)的蛋白卻被保存下來，后者用考馬斯亮藍R250 染色，在光學顯微鏡下可見一種網(wǎng)狀結構。 【實驗用品】1.器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、滴管、擦鏡紙、50ml燒杯； 2.實驗材料：洋蔥鱗莖；3.試劑：1） pH6.8的磷酸緩沖液；索倫森（Sorensen）磷酸緩沖液溶液A：Na2HPO4·2H2O 11.876g加蒸餾水至1L溶液B：KH2PO4 9.08g加蒸餾水至1L對照下表取一定體積的溶液A，再加入足夠的溶液B至總體積達100ml，即得到所需pH的緩沖液。溶液ApH溶液ApH溶

21、液ApH0.64.949.26.881.87.42.35.361.27.085.27.54.95.667.07.188.57.612.16.072.67.293.67.826.46.477.77.396.98.02）M-緩沖液 ：50mmol/L (pH 6.7)咪唑、 50mmol/L KCl 、 0.5mmol/LMgC12  、 1mmol/L  EGTA 、0.1mmol/L EDTA 、 1mmol/L巰基乙醇、 4mmol/L甘油  、1mol/L HCl 調pH

22、 至7.2。 3）1%TritonX-100：用M-緩沖液配制。4）3%戊二醛：用pH6.8的磷酸緩沖液配制。5）0.2%考馬斯亮藍R250 染液：0.8g考馬斯亮藍R250、46.5ml甲醇、7ml冰醋酸 、46.5ml蒸餾水。                            &#

23、160;         6）50，70，95乙醇7）叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性樹膠【實驗步驟】1. 取材：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮0.51cm2，浸入裝有磷酸緩沖液（PH6.8）的小燒杯中，處理510分鐘。2. 去垢處理：棄去PBS緩沖液，用吸水紙吸凈剩余的PBS，加適量1%Triton X-100，使液體充分浸泡材料，并立即放入37恒溫箱或水浴鍋中處理30分鐘。3. 沖洗：吸去1%Triton X-100，立即加入M緩沖液輕輕沖洗3次，每次35分鐘。4. 固定：用吸管將M緩沖液吸盡，加入3%戊二醛，固定1

24、020分鐘。5. 沖洗：吸去3%戊二醛固定液，用磷酸緩沖液（PH6.8）沖洗3次，每次35分鐘。6. 染色：吸去PBS緩沖液，加入適量0.2%考馬斯亮藍R250染料，染色1020分鐘。7. 制片：吸去染料，用水沖洗（注意不要將材料丟失）。將洋蔥表皮伸展鋪平于載玻片上，加蓋蓋玻片。8. 鏡檢：將制好的片子置于低倍鏡下，可見到規(guī)則排列的長方形洋蔥表皮細胞輪廓，細胞質內(nèi)可見到被染成藍色的粗細不等的分枝狀結構，這便是細胞骨架。轉高倍鏡繼續(xù)觀察，調節(jié)細螺旋可見到細胞骨架的立體結構。在有樣品的50ml燒杯中，順序通過如下藥物：50、70、95乙醇，95乙醇叔丁醇（1：1），叔丁醇（每級510min）；或正

25、丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每級510分鐘），然后撈取樣品，平展于載玻片上，經(jīng)鏡檢，效果好的可加一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片?！咀鳂I(yè)與思考】1. 繪出洋蔥細胞的骨架網(wǎng)絡分布。2根據(jù)M-緩沖液的成分，分析其作用。3通過實驗過程，推測你所觀察到的細胞骨架屬于胞質骨架中的哪種類型，為什么？實驗六 PEG法誘導細胞融合【實驗目的】1. 了解細胞融合的原理和過程；2. 初步掌握利用PEG介導動物細胞融合的實驗技術。【實驗原理】細胞融合，即在自然條件下或利用人工法 (生物的、物理的、化學的)，使兩個或兩個以上的細胞合并成一個具有雙核或多核細胞的過程。由于不僅同種細胞可以融合，種間遠緣細胞也能融合，甚至于動植

26、細胞也能合二為一，因此細胞融合技術目前較廣泛應用于細胞生物學、遺傳學和醫(yī)學研究等各個領域，并且取得顯著的成績。化學融合方法一般使用聚乙二醇(PEG)誘導細胞在體外進行融合。商品PEG的相對分子質量有200-6000范圍內(nèi)的各種規(guī)格，它們均可用作細胞融合劑。普遍認為PEG分子能改變各類細胞的膜結構，使兩細胞接觸點處質膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合。促進細胞融合的效力，必須采用較高濃度的PEG溶液，但在高濃度PEG溶液下，細胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的PEG分子量，濃度及作用時間是PEG融合技術的關鍵。

27、該方法的優(yōu)點是：操作簡單，容易獲得融合體，融合效果好。細胞融合率是指在顯微鏡的一個視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細胞(包括已融合的細胞)的細胞核總數(shù)之比，通常以百分比表示?！緦嶒炗闷贰?器材: 離心機、顯微鏡、天平、水浴鍋、滴管、離心管、燒杯、蓋玻片、載玻片。2材料：雞血懸液；3試劑：1）0.85%的生理鹽水；2）GKN液：8.0g的NaCl，0.4g50%（m/V）PEG（37溫?。喝?0gPEG（相對分子質量4000）放入100ml瓶中，高壓滅菌20min。讓PEG冷卻至5060，勿讓其凝固。加入50ml預熱至50的GKN液，混勻，置37備用。3）1%詹那斯綠B；4) Ha

28、nks溶液（含NaCl，KCl, Na2HPO4, MgSO4, CaCl2, 葡萄糖，酚紅）Hanks原液（10×）NaCl 80.0gNa2HPO4·12H2O 1.2gKCl 4.0gKH2PO4 0.6gMgSO4·7H2O 2.0g葡萄糖 10.0gCaCl2 1.4g稱取1.4g的CaCl2，溶于3050ml的重蒸水中。取1000ml的燒杯及容量瓶各一個，先放重蒸水800ml于燒杯中，然后按照上述配方水需，逐一稱取藥品。必須在前一藥品完全溶解后，方可放入下一藥品，直到葡萄糖完全溶解后，再將已經(jīng)溶解的CaCl2溶液加入，最后加水定容至1000ml。Han

29、ks液：Hanks原液 100ml重蒸水 896ml0.5酚紅 4ml配好的Hanks液，分裝包扎好貼上標簽，經(jīng)過滅菌后，4保存?！緦嶒灢襟E】Hanks溶液換成GKN溶液1.雞血紅細胞懸液的制備：將抗凝劑與雞血按1:31:4的比例稀釋，制成雞血紅細胞細胞懸液，放入4冰箱內(nèi)可保存3-4天；2.取雞血1ml，加入4ml0.85%的生理鹽水，1000rpm離心3min, 棄上清液，重復上述操作一次；3.沉淀用適量Hanks溶液重懸浮，1000rpm離心3min, 棄上清液，用Hanks溶液稀釋沉淀，制成10%左右的細胞懸液，迅速在顯微鏡下觀察細胞密度；4. 取1ml上述細胞懸液，加0.5ml 50%

30、 PEG溶液，37水浴中進行細胞融合（30min左右）；5.緩慢加入Hanks溶液，輕輕混勻，終止PEG的作用，使細胞三三兩兩地分散開來（鏡檢），室溫靜置約20min;6.取1小滴懸液于載玻片上，加少量的詹那斯綠B染液，染色5min左右；7.鏡檢，觀察細胞融合現(xiàn)象?！緦嶒灲Y果】1.繪出已融合的細胞形態(tài)圖，描述你所觀察到的細胞融合現(xiàn)象。2.計算細胞融合率?！咀鳂I(yè)與思考】1請分析Hanks溶液的作用是什么（可以從其成分的角度來回答）？2. PEG誘導細胞融合率受哪些因素影響？3你認為在進行細胞融合時，要注意哪些問題?實驗七 動物骨髓細胞染色體標本的制備與觀察【實驗目的】（1）掌握動物骨髓細胞染色體

31、標本的制備技術（2）觀察染色體的數(shù)目以及形態(tài)特征【實驗原理】骨髓細胞具有豐富的細胞質和高度的分裂能力，因此不必經(jīng)體外培養(yǎng)，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可以直接觀察到分裂細胞。經(jīng)過秋水仙素處理后，分裂的骨髓細胞被阻斷在有絲分裂中期，再經(jīng)離心、低滲、固定、滴片等步驟，便可制作出理想的染色體標本，是研究動物細胞遺傳學的好材料。骨髓細胞染色體標本的制備，具有取材容易，方法簡單易行等優(yōu)點，設備也簡單，在一般的實驗室都可進行?！緦嶒瀮x器、材料和試劑】1.儀器：天平、低速離心機、恒溫水浴鍋、顯微鏡、1ml注射器、解剖盤、解剖剪、刀片。試管架、10ml離心管、吸管燒杯、量筒。酒精燈、冰凍載玻片、玻

32、璃板、吸水紙、擦鏡紙2. 材料小白鼠或無尾兩棲類青蛙或蟾蜍3. 試劑1）Carnoy固定液（新配制的甲醇：冰醋酸3:1）2）0.1秋水仙素：稱取10mg秋水仙素，加入10ml的0.65生理鹽水（1ml含有1000ug，0.1ml含有100ug秋水仙素）；3）0.85%生理鹽水；檸檬酸鈉溶液；0.4%KCl溶液（0.075M） 4）0.0667mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）A液：1000ml含Na2HPO4 9.465 g或 Na2HPO4·2H2O 11.876g 或Na2HPO4·12H2O23.88gB液：1000ml含KH2PO4 9.07g取A液80ml+B液2

33、0ml混勻成pH7.45）1:10 Giemsa磷酸鹽緩沖液Giemsa母液：Giemsa粉0.5g，甘油（AR級）33ml，甲醇（AR級）33ml先將少量甘油加入研缽中，將Giemsa粉充分研細，再倒入剩余甘油，并在56溫箱中保溫2h，然后再加入甲醇混勻，儲存在棕色瓶中?！痉椒ㄅc步驟】1.骨髓細胞制備如下表步驟小鼠兩棲動物（1）秋水仙素注射按4ug/g體重注射34h后處死按30ug/g注射78h后處死（2）取后肢脛骨和股骨，切去兩端。（3）取骨髓細胞2%檸檬酸鈉溶液1ml1%檸檬酸鈉溶液1ml用1ml注射器吸取檸檬酸鈉溶液，通過針頭將溶液注入骨髓腔，沖出骨髓細胞置10ml離心管中（細胞沖凈后

34、骨髓腔由粉紅變?yōu)榘咨徽翎橆^，用注射器筒輕輕反復吸打，使分散成單個細胞。（4）低滲處理預熱及低滲水浴溫度：37低滲時間：30min預熱及低滲水浴溫度：26低滲時間：30min視細胞多少加入79ml 預熱的0.4%KCl溶液，在水浴中低滲處理。2. 1000rpm離心8min。3. 棄上清，沿離心管壁緩慢加入新配制的甲醇：冰醋酸（3:1）固定液5ml，注意不要沖動細胞團塊。加完后立即用吸管將細胞輕輕吸打均勻，靜置固定20min。如此反復固定23次，每次20min。4 固定的細胞經(jīng)離心后，吸去上層固定液，視管底的細胞多寡加入少量新配制的固定液，細胞團塊輕輕吸打成懸液（注意：吹打不要過于用力）。

35、5. 在干凈并預冷的載玻片上滴23滴細胞懸液，干燥。（注意：滴片時滴管離載玻片有一定高度有助于染色體分散）6. 將玻片細胞面朝上水平放置，滴加1:10 Giemsa磷酸鹽緩沖液34ml，染色10min。7. 沖洗掉染液，干燥后鏡檢?！窘Y果分析】（1）樣品的染色體數(shù)目是多少？19對常染色體，1對性染色體。共40條（2）要成功制備染色體標本，在操作中應注意哪些問題？【實驗提示】過去實驗中曾經(jīng)出現(xiàn)的問題（1）染色后發(fā)現(xiàn)沒有骨髓細胞原因：未能將細胞從骨髓腔中洗出；離心不慎造成細胞流失；低滲過度造成細胞破裂，染色體流失；沖洗不慎等（2）染色體分散不佳而造成無法計數(shù)原因：低滲控制不好造成細胞體積過?。桓稍?/p>

36、過度等注意：隨時鏡檢才能確定各步驟是否存在問題低滲與離心等步驟的操作要輕。 觀察細胞的標準為：1細胞完整，輪廓清晰，染色體分布在同一水平面上。2染色體形態(tài)和分布良好。3最好無重疊，即使有個別重疊，也要能明確辯認，以免差錯。4所觀察的細胞處于同一有絲分裂階段，即染色體螺旋化程度或染色體長短大致一樣。在所觀察的細胞周圍，沒有離散的單個或多個染色體存在，以免影響計數(shù)。 【作業(yè)和思考】選擇染色體清晰，分散度好的中期分裂相，計數(shù)染色體，顯微攝影，打印出照片。在制備小鼠骨髓細胞染色體時為什么要進行預固定？因為在之前你得到的染色體都處于不同的分裂期，預固定是為了使這些細胞及其染色體都固定在當前所處的時期，便

37、于觀察。其實質就是把細胞殺死，使其無法繼續(xù)進行有絲分裂。天才是由于對事業(yè)的熱愛而發(fā)展起來的。簡直可以說，天才就其本質而論只不過是對事業(yè)，對工作的熱愛而已。綜合大實驗：煙草愈傷組織細胞的培養(yǎng)及細胞凋亡的誘導和觀察【實驗目的】1. 將煙草的懸浮細胞誘導發(fā)生細胞凋亡。2. 了解和掌握凋亡細胞的瓊脂糖凝膠電泳檢測（DNA梯狀條帶）。3. 掌握凋亡細胞的形態(tài)學觀察方法。【實驗原理】細胞凋亡被分為兩類：受體介導的細胞凋亡和線粒體介導的細胞凋亡。本實驗主要涉及線粒體介導的細胞凋亡。凋亡的細胞可用多種方法來檢測。凋亡出現(xiàn)時，細胞內(nèi)源性的核酸內(nèi)切酶被激活，將染色質DNA自核小體間降解，形成相差180-200bp

38、的大小不等寡核苷酸片段。提取凋亡細胞的DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳，分離不同長度的DNA片段，再經(jīng)溴化乙錠染色，在凝膠成像儀下觀察，可見特征性的梯狀條帶。這就是凋亡細胞的瓊脂糖凝膠電泳檢測?！緦嶒灢襟E】（一）細胞凋亡的誘導1. 48熱激煙草懸浮細胞2、4、8小時后，恢復25培養(yǎng)12小時，用于細胞凋亡的檢測。2. 4處理煙草懸浮細胞2、4、8個小時后，恢復25培養(yǎng)12小時，用于細胞凋亡的檢測。3. 200、400、800ppm的乙烯利處理煙草懸浮細胞12小時后，用于細胞凋亡的檢測。（二）凋亡細胞的瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗用品1. 材料：已被誘導凋亡的煙草懸浮細胞2. 試劑：瓊脂糖，2×CTAB緩沖液（2% CTAB、100mmol/L Tris-HCL(pH8.0)、20mmol/L EDTA(pH8.0)、1.4mol/L NaCL、1% PVP），氯仿，異戊醇，乙醇，異丙醇，液氮3. 儀器：高速冷凍離心機，恒溫水浴，電泳裝置實驗步驟1. 在1.5ml Eppendorf管中，加入500l的2×CTAB緩沖液，