高效液相色譜法測定水樣中的苯酚

1、實(shí)驗(yàn)三高效液相色譜法測定水樣中的苯酚一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1熟悉HPLC儀器的各個(gè)部件及熟悉操作方法；1.2掌握應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)苯酚的定性、定量分析;1.3掌握水樣中苯酚的測定。二、實(shí)驗(yàn)原理HPLC® 理高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上， 流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá) 4.9'107Pa）;色譜柱是以特殊的方法 用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高丁經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá) 幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。 特點(diǎn)1 .高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻 力較

2、大，為了迅速地通過色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。一般可達(dá) 150 350 xi05Pa。2. 高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)110ml/min。高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少丁1h。3. 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。4. 高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進(jìn)一步提高了分析的 靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達(dá) 10-11g。另外，用樣量小，一般幾個(gè)微升。5. 適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn) 太高的物質(zhì)或熱

3、穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難丁應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì) 丁高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大（大丁 400以上）的有機(jī)物（這些物質(zhì) 幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%80% ）原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來進(jìn)行分 離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%,而能用液相色譜分析的約占7080%。高效液相色譜儀一般分為四個(gè)部分：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)和 檢測系統(tǒng)。此外還可以根據(jù)一些特殊的要求配備一些附屆裝置， 如梯度洗脫、自 動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理裝置等，如圖1所示。井氣道圖1液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖及工作流程圖方法原

4、理：在相同的色譜條件下，相同物質(zhì)具有相同的保留時(shí)間，據(jù)此可 對(duì)某物質(zhì)進(jìn)行定性分析；在一定濃度范圍內(nèi)，待測物質(zhì)含量與儀器響應(yīng)值呈線性 關(guān)系，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測物質(zhì)的定量分析。三、儀器和試劑1、儀器：島津（SHIMADZU ） LC-20A液相色譜儀： 流動(dòng)相：乙睛、 MQ水（由鋁箔紙包裹，防止其中產(chǎn)生藻類，堵塞進(jìn)口） 高壓輸液泵：并聯(lián)式微體積柱塞往復(fù)泵（Prominence LIQUID CHROMATOGRAPH ）型號(hào)：LC-20AD廠家：UFLC SHIMADZU 色譜柱：固定相填充物：十八碳（C18 ）型號(hào)：Intertsil ODS-SP參數(shù)：填充物粒徑：5 m 內(nèi)徑X長度

5、：4.6 X250 mm 檢測器：二極管陣列檢測器（PDA）型號(hào)：SPD-M20A 電壓：230V廠家：SHIMADZU 脫氣裝置：型號(hào)：DQO-20A5 進(jìn)樣裝置：高壓六通進(jìn)樣閥兩個(gè)狀態(tài)：Load :樣品進(jìn)入六通閥，未入色譜柱Inject :位于六通閥的樣品進(jìn)入色譜柱種類：SIL-10A 、SIL-10Ai 、SIL-10ADVP淋洗液（洗針、洗閥）：甲醇移液管2 mL、5 mL各一支具塞離心管 10 mL 三支、1.5 mL 一次性離心管一支2.試劑：甲醇（色譜純）；苯酚標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（10 mg/L） 待測水樣。四、實(shí)驗(yàn)步驟1標(biāo)準(zhǔn)系歹U配制取苯酚標(biāo)準(zhǔn)使用液0.50、1.00、2.00 mS

6、 10 mL的具塞離心管中，用甲醇定 容至5 mL,混勻。待測。2樣品的制備取水樣約1 mb 1.5 mL一次性離心管中。待測。3色譜參數(shù)色譜柱：C18柱；流動(dòng)相：乙臘、水;梯度洗脫程序：洗脫時(shí)間0:004:004:015:005:018:00乙臘（%）656575756565流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 H %檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長 280 nm4測定測定標(biāo)準(zhǔn)系歹0,再測定樣品。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)系歹0中苯酚的保留時(shí)間， 定性確定樣 品中的目標(biāo)物。記錄標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品中目標(biāo)物的峰面積。五、數(shù)據(jù)記錄與計(jì)算（1）標(biāo)準(zhǔn)系歹U c=4mg/mL 的譜圖及樣品的譜圖：樣品譜圖（

7、圖2）中，三個(gè)明顯高的峰的記錄數(shù)據(jù)如下表表1樣品的譜圖中三個(gè)峰的特征數(shù)據(jù)保留時(shí)間（t/min ）色譜峰面積/counts色譜峰高/mAU第一個(gè)峰3.892229072928第二個(gè)峰4.307182.47第三個(gè)峰4.879205676.0 '280nm,4nm (1.00)65.5 '735.0A11-4.5 ' i4.03.5 '_1_3.0 '2.5 '1_1l_2.0 '_L_1.5 '1.0 -0.5 _0.0 -1 rIL一一八J-0.5 -111 i1 J .-, ,”.-mAU0.00.51.01.52.02.53.0

8、3.54.04.5min圖1 標(biāo)準(zhǔn)系列c=4mg/mL 的譜圖圖2樣品的譜圖2.標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品中苯酚的保留時(shí)間、峰面積、峰高等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù):表2標(biāo)準(zhǔn)系列和樣品中苯酚的譜圖峰的特征數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品體積/mL保留時(shí)間t/min色譜峰面積/counts色譜峰高/mAU濃度/(mg/mL)10.53.9511764012091.021.03.8373475429632.032.03.7736662552584.0樣品一3.8922290729281.3六、思考題1液相色譜使用的注意事項(xiàng)；答：流動(dòng)相必須用HPL徵的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì) （使用0.45um或更細(xì)的膜過濾），氣泡會(huì)致使壓力

9、不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過 程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑活洗進(jìn)樣器， Cl"絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使 用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的活洗， 更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾 頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中，更換無互溶性的流動(dòng) 相時(shí)要用異丙醇過渡一下。2何謂梯度洗脫，有何特點(diǎn)；答：梯度洗脫是采用兩種（或多種）不同洗脫能能力的溶劑，在分離過程中按一定 程序連續(xù)改變流動(dòng)相的濃度配比和極性的一種洗脫模式.當(dāng)樣品混合物中化合物 的保留差異很大，用單一流動(dòng)相等度洗脫時(shí)，分離時(shí)間太長，而且隨保留值增大, 后洗脫的色譜峰譜帶變寬，使峰檢測發(fā)生困難.有時(shí)甚至?xí)l(fā)生部分化合物保留 太強(qiáng)，不能洗脫下來，此時(shí)采用梯度洗脫.梯度洗脫一般用液相色脯裝置來實(shí)現(xiàn). 高壓梯度，低壓梯度兩種裝置.3正相高效液相色譜與反相有何差別。答：高效液相色譜法包括