引物設(shè)計(jì)的幾點(diǎn)重要原則

1、PCR引物設(shè)計(jì)的11條黃金法則 1引物最好在模板 cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件(比如 DNAman)比對(duì)(Alignment)，各基因相同的序列就是該基因 的保守區(qū)。2.引物長(zhǎng)度一般在 1 530堿基之間。引物長(zhǎng)度( primerlength )常用的是 18-27bp ，但不應(yīng)大于 38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度 大于74C，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。3引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72 C。GC含量(composition )過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的G

2、C含量不能相差太大。另外，上下游引物的 Tm 值( meltingtemperature )是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽 濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4 ( G+C) +2 (A+T)估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的 Tm為5580C,其Tm值最 好接近72 C以使復(fù)性條件最佳。4引物3'端要避開(kāi)密碼子的第 3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物 3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第 3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。5. 引物3'端不能選擇 A，最好選擇T。引物3'端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效

3、率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為 T 時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于 A、T之間，所以3'端最好選擇To6. 堿基要隨機(jī)分布。 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高， 尤其是 3'端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)(Falsepriming)。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是 隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3 '端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，

4、否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin )使引物本身復(fù)性。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免 Crossdimer)的形成。引物之間不能有連續(xù) 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。 引物自身不能有連續(xù) 4個(gè)堿基的 互補(bǔ)。3'端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體( Dimer 與4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。應(yīng)盡量使其G值不要過(guò)高(應(yīng)小于4.5kcal/mol )。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8. 引物5'端和中間G值應(yīng)該相對(duì)較高，而 3'端AG值較低。GG 值是指 DNA 雙鏈形

5、成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5 '端和中間G值相對(duì)較高，而3 '端AG值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9）的引物。引物3 '端的AG值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（不同位置的 G 值可以用 Oligo6 軟件進(jìn)行分析）9引物的5'端可以修飾，而 3 '端不可修飾。引物的5 '端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影 響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等； 引入蛋白質(zhì)結(jié)合 DNA序列；引入點(diǎn)

6、突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。 引物的延伸是從 3'端開(kāi)始的， 不能進(jìn)行任何修飾。 3'端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。某些引物無(wú)效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響， 選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié) 構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如 RNAstructure）可以預(yù)測(cè)估計(jì) mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選 擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（ G ）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不 能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用 7-deaza-2'-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。11. 引物應(yīng)具有特異性。引

7、物設(shè)計(jì)完成以后， 應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。附：值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。做RealTime時(shí)用于SYBRGreen法時(shí)的一對(duì)引物與一般 PCR的引物，在引物設(shè)計(jì)上所要求的 參數(shù)是不同的。引物設(shè)計(jì)的要求：1）避免重復(fù)堿基，尤其是 G.2）Tm=58-60 度。3）GC=30-80%.4）3'端最后 5 個(gè)堿基內(nèi)不能有多于 2

8、 個(gè)的 G 或 C.5）正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。6）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150bp最為合適（可以延長(zhǎng)至 300bp）。7）引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRE都應(yīng)該可以的。做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物， 你要有從

9、一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備-尋找合適的引物非常不容易。關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過(guò)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計(jì)的這個(gè)引物，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開(kāi)的不物種基因序列當(dāng)中， 除了和你的目標(biāo)基因之外， 還有沒(méi)有和其他物種或其他序列 當(dāng)中存在相同的序列， 如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列， 則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn) 物，那么這個(gè)引物的特異性就很差，從而不能用。1簡(jiǎn)介 寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)成功的關(guān)鍵。所選的引物序列將決定PCR 產(chǎn)物的大小、位置、以及擴(kuò)增區(qū)域的Tm值這個(gè)和擴(kuò)增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計(jì)可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PC

10、R中也能識(shí)別CDNA或基因組模板。引物設(shè)計(jì)也極大的影響擴(kuò)增產(chǎn)量： 若使用設(shè)計(jì)粗糙的引物， 產(chǎn)物將很少甚至沒(méi)有； 而使用正 確設(shè)計(jì)的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當(dāng)然，即使有了好的引物， 依然需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。計(jì)算機(jī)輔助引物設(shè)計(jì)比人工設(shè)計(jì)或隨機(jī)選取更有效。一些影響PCR反應(yīng)中引物作用的因素諸如溶解溫度、 引物間可能的同源性等， 易于在計(jì)算機(jī)軟件中被編碼和限定。計(jì)算機(jī)的高速度可完成對(duì)引物位置、 長(zhǎng)度以及適應(yīng)用戶特殊條件的其他有關(guān)引物的變換可能性的大量計(jì)算。 通過(guò)對(duì)成千種組合的檢測(cè)， 調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)， 可提出適合

11、用戶特殊實(shí)驗(yàn)的引物。因此通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件選擇的引物的總體 “質(zhì)量”（由用戶在程序參數(shù)中設(shè)定） 保證優(yōu)于通過(guò)人工導(dǎo)出的引物。 需要指出的是，引物不必與模板完全同源，因此可包含啟動(dòng)子序列、限制酶識(shí)別位點(diǎn)或5'端的各種修飾，這種對(duì)引物的修飾不會(huì)妨礙 PCR反應(yīng)，而會(huì)在以后使用擴(kuò)增子時(shí)發(fā)揮作用。2 .基本PCR引物設(shè)計(jì)參數(shù) 引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡： 擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。 特異性是指發(fā)生錯(cuò)誤引 發(fā)的頻率。特異性不好或劣等的引物會(huì)產(chǎn)生額外無(wú)關(guān)和不想要的PCR擴(kuò)增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見(jiàn)到；引物效率是指在每一PCR循環(huán)中一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物與理論上成倍增長(zhǎng)量的接近程度。 引物長(zhǎng)度

12、；特異性一般通過(guò)引物長(zhǎng)度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設(shè)置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內(nèi)，18 到 24 個(gè)堿基的寡核苷酸鏈?zhǔn)怯泻芎玫男蛄刑禺愋缘?。引物越長(zhǎng)，擴(kuò)增退火時(shí)被引發(fā)的模板越少。為優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保溶解溫度不低于54C的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性?？偟膩?lái)說(shuō)，最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。每增加一個(gè)核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為 18個(gè)核苷酸。引物設(shè)計(jì)時(shí)使合成的寡核苷酸鏈 （18 24 聚物）適用于多種實(shí)驗(yàn)條件仍不失為明智之舉。 引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、 發(fā)卡結(jié)構(gòu)、 引物間二聚體等。 這些因素

13、會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而 影響引物效率。對(duì)于引物的3'末端形成的二聚體， 應(yīng)控制其 AG大于-5.0kcal/mol或少于三個(gè) 連續(xù)的堿基互補(bǔ)， 因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或 5'端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3'端或近 3'端對(duì)引物 -模板結(jié)合影響更大； 影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3'末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。 引物 GC 含量和 Tm 值PCR引物應(yīng)該保持合理的 GC含量。含有50%的G+C的20個(gè)堿基的寡核苷酸鏈的 Tm值大 概

14、在5662C范圍內(nèi)，這可為有效退火提供足夠熱度。一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。協(xié)調(diào)性差的引物對(duì)的效率和特異性都較差，因?yàn)榻档土薚m值導(dǎo)致特異性的喪失。這種情況下引物 Tm 值越高，其錯(cuò)誤引發(fā)的機(jī)率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm 值低的引物對(duì)可能完全不發(fā)揮作用。 在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對(duì)新的 引物時(shí)，這種 GC含量和Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。一般來(lái)說(shuō)，一對(duì)引物的Tm值相差盡量不超過(guò)23攝氏度，同時(shí)引物和產(chǎn)物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。 引物的額外序列與退火溫度若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、限制酶切位點(diǎn)或者 GC發(fā)

15、夾結(jié)構(gòu)可以使用加長(zhǎng)的引物。 一般說(shuō)來(lái)， 引物 5'端添加無(wú)關(guān)序列不會(huì)影響引物特異序列的退 火。有時(shí)候，引物中添加了大量與模板不配對(duì)的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進(jìn)行4到 5 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)； 然后在假定引物 5'端序列已經(jīng)加入到模板中， 計(jì)算得出的退火溫度下進(jìn)行 其余的循環(huán)。在引物上添加限制酶位點(diǎn)時(shí)一個(gè)重要的考慮是大多數(shù)限制酶的有效切割要求在它們的識(shí)別 序列的 5'端有 2 至 3 個(gè)非特異的額外堿基， 這樣就會(huì)增加引物的非模板特異序列的長(zhǎng)度。 長(zhǎng) 引物序列的另一個(gè)缺點(diǎn)是影響溶解溫度的精確計(jì)算，而這對(duì)于確定PCR反應(yīng)時(shí)的退火溫度又是必須的。對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物，Tm

16、值可以根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T計(jì)算。而對(duì)于較 長(zhǎng)的引物，Tm值需要考慮動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從最近鄰位”的計(jì)算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都采用這種方式。 引物的 3'末端核苷酸組成引物 3'末端和模板的堿基完全配對(duì)對(duì)于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物3'末端最后 5到 6 個(gè)核苷酸的錯(cuò)配應(yīng)盡可能的少。 如果 3'末端的錯(cuò)配過(guò)多， 通過(guò)降低反應(yīng)的退火溫度來(lái)補(bǔ) 償這種錯(cuò)配不會(huì)有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。引物 3'末端的另一個(gè)問(wèn)題是防止一對(duì)引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補(bǔ)， 尤其是在3'末端。引物間的互補(bǔ)將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體

17、的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實(shí)是引物自身的擴(kuò)增。這將會(huì)在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)PCR狀態(tài)，從而影響擴(kuò)增成功。引物3'末端的穩(wěn)定性由引物 3'末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個(gè)堿基的AG。此值的大小對(duì)擴(kuò)增有較大的影響，負(fù)值大，則 3'末端穩(wěn)定性高， 擴(kuò)增效率更高，同時(shí)也更易于異位引發(fā)。需要注意的是，引物 3'末端應(yīng)盡量避免 T。實(shí)驗(yàn)證明，以T結(jié)尾的引物即使與 T,G或C錯(cuò)配 仍可有效延伸。 PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度及在耙序列內(nèi)的位置所有的計(jì)算機(jī)程序都提供對(duì) PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍的選擇。一般說(shuō)來(lái)，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度對(duì)擴(kuò)增效率 有影響。特定的應(yīng)用情況下，PCR產(chǎn)物

18、長(zhǎng)度部分取決于模板材料。預(yù)期產(chǎn)物的特定長(zhǎng)度經(jīng)常取決于應(yīng)用的需要。若目的是建立測(cè)定特異DNA 片段的臨床檢驗(yàn)方法，120300bp的小DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可能是最好的。產(chǎn)物應(yīng)具有好的特異性和高的產(chǎn)生效 率，并含有能用于探針捕捉雜交實(shí)驗(yàn)的足夠信息。 這一長(zhǎng)度范圍的產(chǎn)物可以通過(guò)采用兩步擴(kuò) 增循環(huán)方法得到，從而減少擴(kuò)增時(shí)間。其他PCR方法有不同的最佳產(chǎn)物長(zhǎng)度。例如，通過(guò)定量的RNA-PCR檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物 應(yīng)該足夠大以便構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性模板，這樣，產(chǎn)物和競(jìng)爭(zhēng)物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來(lái)。這些產(chǎn)物一般在 250750bp范圍內(nèi)。 補(bǔ)充說(shuō)明若在cDNA序列內(nèi)找尋PCR引物，需特別注意兩點(diǎn)：首先，盡力將引物和產(chǎn)

19、物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)， 因?yàn)檫@是生成蛋白質(zhì)的獨(dú)特序列，不像 3'末端非編碼區(qū)域與許多其他 mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。若PCR的目的是克隆一個(gè)基因或cDNA的特異序列，產(chǎn)物的大小是根據(jù)具體應(yīng)用預(yù)選的。在這里，計(jì)算機(jī)程序可以提供關(guān)于期望區(qū)域側(cè)翼選擇引物對(duì)的信息。在選擇用來(lái)擴(kuò)增來(lái)自不同物種DNA的引物時(shí)，應(yīng)避開(kāi) mRNA的5'和3'末端非翻譯區(qū)序列，因?yàn)樗鼈兛赡軟](méi)有任何的同源性。3簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物時(shí)， 一定要檢查靶擴(kuò)增區(qū)域選定氨基酸遺傳密碼的簡(jiǎn)并度。很顯然， 我們期望選擇簡(jiǎn)并度最低的氨基酸，達(dá)到提高特異性的目的。 充分注意物種對(duì)于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子， 以降低引物的簡(jiǎn)并性。