急性肺損傷中性粒細(xì)胞膠原酶表達(dá)異常及甲基強(qiáng)的松龍調(diào)控的研究

1、急性肺損傷中性粒細(xì)胞膠原酶表達(dá)異常及甲基強(qiáng)的松龍調(diào)控的研究 作者：陸衛(wèi)華 曾尟枚 許喜詠 程青 唐忠志【摘要】 目的： 探討急性肺損傷時(shí)肺組織中性粒細(xì)胞膠原酶的表達(dá)及甲基強(qiáng)的松龍調(diào)控關(guān)系。方法： SD大鼠45只，分為3組：1組生理鹽水正常對(duì)照組，2組內(nèi)毒素(LPS)致病組，3組內(nèi)毒素(LPS)+甲基強(qiáng)的松龍組。組2、組3分別由尾靜脈注射內(nèi)毒素(5 mg/kg)造成大鼠急性肺損傷模型，組1則注入生理鹽水。內(nèi)毒素(LPS)+甲基強(qiáng)的松龍組在實(shí)驗(yàn)造模前2 d由腹腔注射甲基強(qiáng)地松龍10mg/kg，1次/d，組1、組2、組3分別于注射后6 h建模后各組均取左肺標(biāo)本，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中中性粒細(xì)胞

2、膠原酶的表達(dá)，并行肺病理?yè)p傷評(píng)分、肺內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算肺干/濕質(zhì)量比。結(jié)果:內(nèi)毒素(LPS)致病組和內(nèi)毒素(LPS)+甲基強(qiáng)的松龍組高于正常對(duì)照組中性粒細(xì)胞膠原酶相對(duì)含量、肺病理?yè)p傷評(píng)分、肺干/濕質(zhì)量比、肺內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) (P<005)。內(nèi)毒素(LPS)致病組高于內(nèi)毒素(LPS)+甲基強(qiáng)的松龍組中性粒細(xì)胞膠原酶相對(duì)含量、肺病理?yè)p傷評(píng)分、肺干/濕質(zhì)量比、肺內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) (P<005)。結(jié)論:急性肺損傷性粒細(xì)胞膠原酶表達(dá)異常與肺損傷有密切關(guān)系，甲基強(qiáng)的松龍能調(diào)控急性肺損傷時(shí)中性粒細(xì)胞膠原酶的表達(dá)異常。 【關(guān)鍵詞】 急性肺損傷； 中性粒細(xì)胞膠原酶； 甲基強(qiáng)的松龍

3、2 / 11急性肺損傷(ALI)是全身反應(yīng)綜合征(SIRS) 的重要組成部分，在內(nèi)毒素(LPS)導(dǎo)致的急性肺損傷(ALI)中，中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集并且釋放炎癥因子是一個(gè)重要的致病環(huán)節(jié)1。為了解中性粒細(xì)胞膠原酶在ALI發(fā)病中所起的作用，作者采用尾靜脈注射LPS法構(gòu)建了ALI大鼠模型，并觀察中性粒細(xì)胞膠原酶在ALI中的作用，并用甲基強(qiáng)的松龍進(jìn)行調(diào)控干預(yù)，收到顯著效果。 1 材料和方法 1.1 動(dòng)物分組 SD大鼠45只，購(gòu)至華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量(200±40)g，隨機(jī)分為3組：生理鹽水對(duì)照組15只；內(nèi)毒素(LPS)模型組15只；內(nèi)毒素(LPS)+甲基強(qiáng)的松龍組15只。

4、甲基強(qiáng)的松龍購(gòu)自美國(guó)輝瑞-法瑪西亞公司生產(chǎn)。 1.2 動(dòng)物模型制備 固定大鼠，先靜脈注射3mg/L苯巴比妥鈉(30mg·kg-1)麻醉, 5min后經(jīng)尾靜脈注射(5 mg·kg-1)LPS復(fù)制大鼠ALI模型。生理鹽水對(duì)照組注射同量生理鹽水。內(nèi)毒素(LPS)+甲基強(qiáng)的松龍組在實(shí)驗(yàn)造模前2 d由腹腔注射甲基強(qiáng)的松龍10mg/kg，1次/d。造模后6h分別經(jīng)靜脈注射過(guò)量的苯巴比妥鈉處死，取左下葉肺組織一塊，-70 凍存待檢。對(duì)照組大鼠不注射LPS，處死后取左下葉肺組織。 1.3 測(cè)肺組織中性粒細(xì)胞膠原酶檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)SABC法，一抗是多克隆山羊抗大鼠中性粒細(xì)胞膠原酶抗體(

5、中山生物公司)。肺組織石蠟包埋后切片，固定于多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上。經(jīng)梯度乙醇脫水、脫蠟后，又經(jīng)甲醇處理5min后，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。磷酸緩沖液(pH60)120加熱5 min。滴加一抗孵育30 min，然后滴加二抗，再孵育30 min后，加入顯色劑DAB。細(xì)胞漿中顯棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，以半定量的方法判斷結(jié)果 ，陽(yáng)性細(xì)胞定量參數(shù)用MPIAS-1000型光密度自動(dòng)分析儀(Nikon，Japan)進(jìn)行檢測(cè)。 1.4 肺組織病理?yè)p傷評(píng)分 標(biāo)本經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察。根據(jù)Tomashefski等介紹的10個(gè)觀察指標(biāo)(肺泡上皮細(xì)胞破壞、毛細(xì)血管阻塞、肺間質(zhì)水腫、肺泡內(nèi)水腫、出血、單核細(xì)胞浸潤(rùn)

6、、多型核細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間質(zhì)水腫、透明膜形成、間質(zhì)膠原降解)判斷肺損傷：分4個(gè)級(jí)別，0為未觀察到損傷、1為輕度、2為中度、3為重度。每張切片各觀察指標(biāo)病理評(píng)分的總和為該切片總評(píng)分，每組觀察5張切片，取均值。 1.5 肺組織干/濕質(zhì)量比 取左下葉肺組織稱量， 70烘烤24 h后再稱量，計(jì)算肺干/濕質(zhì)量比。 1.6 肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 標(biāo)本經(jīng)HE染色后在400倍顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)。 1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用均數(shù)方差分析，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行處理，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P<005為差異有顯著性。 2 結(jié)果 各組

7、大鼠中性粒細(xì)胞膠原酶含量、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺干/濕質(zhì)量比、病理評(píng)分結(jié)果見表1。HE染色結(jié)果顯示: C組中未見到肺組織炎癥反應(yīng)見（圖1）, L組可觀察到嚴(yán)重的肺炎癥反應(yīng)見（圖2）,即中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、透明膜形成、肺泡間組織腫脹突入肺泡腔中,M組肺炎癥較L組減輕見（圖3）。中性粒細(xì)胞膠原酶染色結(jié)果顯示: C組中幾乎未見中性粒細(xì)胞膠原酶染色陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞, L組可見強(qiáng)陽(yáng)性染色中性粒細(xì)胞,并且主要定位于細(xì)胞漿中，M組中中性粒細(xì)胞膠原酶染色陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞較L組減少。表1 各組大鼠中性粒細(xì)胞膠原酶相對(duì)含量、肺病理?yè)p傷評(píng)分、肺干濕質(zhì)量比、肺內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 3 討論 急性肺損傷是急性創(chuàng)傷和感染常見病。在臨

8、床ICU所有治療病例中，由細(xì)菌內(nèi)毒素所引發(fā)的ALI和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)占有重要比例，其發(fā)病率和病死率均較高2,3。在對(duì)ALI的研究中，均可以觀察到有大量中性粒細(xì)胞在肺組織中聚集，而中性粒細(xì)胞可以釋放多種炎癥介質(zhì)導(dǎo)致ALl的發(fā)生4,5，因而目前對(duì)于這些炎癥介質(zhì)的研究是一個(gè)熱點(diǎn)。 人體組織器官是由各種細(xì)胞成分及細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)構(gòu)成，ECM 是維系器官結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基礎(chǔ)在器官構(gòu)成中起"框架"作用。中性粒細(xì)胞膠原酶是基質(zhì)金屬蛋白酶中的一種，僅來(lái)源于成熟分化的中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞膠原酶能降解ECM 中的、 、 型膠原成分，而這3種膠原成分是ECM 中的重要組成成分，對(duì)

9、組織結(jié)構(gòu)起連接、支持、穩(wěn)定作用 ，所以，在炎癥反應(yīng)性疾病中，中性粒細(xì)胞膠原酶分泌增多，必然大量分解ECM 中的膠原成分，造成組織器官結(jié)構(gòu)與功能破壞，持續(xù)釋放大量的毒性內(nèi)容物加劇肺損傷的病理過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全符合此結(jié)論6,7。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示在急性肺損傷組中性粒細(xì)胞膠原酶含量顯著高于生理鹽水正常對(duì)照組和內(nèi)毒素(LPS)甲基強(qiáng)的松龍組。說(shuō)明急性肺損傷組中性粒細(xì)胞膠原酶含量明顯異常。內(nèi)毒素(LPS)急性肺損傷組和內(nèi)毒素(LPS)甲基強(qiáng)的松龍組中性粒細(xì)胞膠原酶含量差異有顯著性。內(nèi)毒素(LPS)甲基強(qiáng)的松龍組中性粒細(xì)胞膠原酶含量較內(nèi)毒素急性肺損傷組比例顯著減少。說(shuō)明甲基強(qiáng)地松龍能夠調(diào)控油酸內(nèi)毒素(L

10、PS)造成急性肺損傷后中性粒細(xì)胞膠原酶含量，對(duì)急性肺損傷有明顯有保護(hù)作用。但是甲基強(qiáng)的松龍對(duì)急性肺損傷有明顯有保護(hù)作用尚不能完全抵消內(nèi)毒素肺損傷肺組織中PMN釋放中性粒細(xì)胞膠原酶的影響。其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 徐興祥炎癥過(guò)程中白細(xì)胞募集的分子機(jī)制國(guó)外醫(yī)學(xué)·呼吸系統(tǒng)分冊(cè)，2001，21(1)：13.2 Tamura DY, Moore EE, Partrick DA, et al. Acute hypoxmia in humans enhances the neutrophil inflammatory response. Shock, 2002, 17(11):

11、269.3 Qing Lu Elizabeth O, Harrington,et al.Apoptosis and lung injury.Keio J Med,2005,54(4):184189.4 Hussain N，Wu F，Zhu L et alNeutrophil apoptosis duringthe development and resolution of oleic acid-induced acute lunginjury in the ratAm J Respir Cell Mol Biol，1998，19(6)： 8678745 Yan XX,Jiang Ym，Li H

12、L，et alThe Alteration of Na-K-ATPaseactivity and the reaction of dexamethasone observed OH diferentacute lung injury models of ratsSect Respir Sys Foreign MedSci，2005，25(7)：4814836 Han SX，Han XM，Wu XM，et a1Investigation of eosinophilapoptosis in asthma patients.China Joumat of ModemMedicine，2004，14(7)：15177 Ranieri MCellular mechanisms of acute lung injury and res-olution： Inflammatorymediators in