飼料中沙門氏菌的監(jiān)測概況及常規(guī)檢測技術(shù)應(yīng)用

1、飼料中沙門氏菌監(jiān)測情況及常規(guī)檢測技術(shù)的應(yīng)用 常規(guī)沙門氏菌檢測技術(shù)的應(yīng)用 背景 1 飼料中沙門氏菌污染情況23背景沙門氏菌的檢測是各國檢驗機構(gòu)對多種食品的必檢項目之一公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一引起食物中毒的重要病原菌在各類細菌性的食物中毒中沙門氏菌常居前列不得檢出飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)歐盟ICMSFCAC沙門氏菌DANIEL ELMER DANIEL ELMER SALMONSALMON, , (1850-1914)(1850-1914)美國獸醫(yī)微生物和病理學(xué)家。美國獸醫(yī)微生物和病理學(xué)家。是美國授予的第一位獸醫(yī)學(xué)是美國授予的第一位獸醫(yī)學(xué)博士。博士。18841884年任美國農(nóng)業(yè)

2、部年任美國農(nóng)業(yè)部畜牧局首任局長。他首次從畜牧局首任局長。他首次從病豬中分離出豬霍亂沙門氏病豬中分離出豬霍亂沙門氏菌。在醫(yī)學(xué)微生物中通用的菌。在醫(yī)學(xué)微生物中通用的沙門氏菌一詞，就是為紀(jì)念沙門氏菌一詞，就是為紀(jì)念他而以他的名字命名的。他而以他的名字命名的。沙門氏菌（Salmonella）一群形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相類似的桿菌，種類繁多。已發(fā)現(xiàn)2500多種血清型，我國目前發(fā)現(xiàn)的有200多種血清型。沙門氏菌主要生物學(xué)性狀革蘭氏陰性短桿菌，革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢和莢膜，有無芽孢和莢膜，有鞭毛（除雞白痢沙鞭毛（除雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌外），大多門氏菌外），大多數(shù)具有毛。數(shù)

3、具有毛。需氧或兼性厭氧；普通營養(yǎng)瓊脂上需氧或兼性厭氧；普通營養(yǎng)瓊脂上生長良好。生長良好。7-457-45均可生長，最適溫度均可生長，最適溫度3737，最適最適pH6.8-7.8pH6.8-7.8。抵抗力60 20-30min即被殺死在水中能生存23周在糞便中可生存12個月在冰中能生存3個月 沙門氏菌生物學(xué)特性 傷寒沙門氏菌傷寒沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌雞傷寒沙門氏菌及一部分及一部分雞白痢雞白痢沙門氏菌沙門氏菌發(fā)酵糖不產(chǎn)氣，大多數(shù)雞白痢沙門氏菌不發(fā)發(fā)酵糖不產(chǎn)氣，大多數(shù)雞白痢沙門氏菌不發(fā)酵麥芽糖。酵麥芽糖。O抗原抗原 Vi抗原抗原H抗原抗原OO抗原抗原：為脂多糖，多糖部分決定其特異性，耐熱：為脂多糖

4、，多糖部分決定其特異性，耐熱(100(100、2.5h2.5h不破壞不破壞) )，其特異性不易喪失或變異。，其特異性不易喪失或變異。H H抗原抗原：H H抗原存在于鞭毛中，蛋白質(zhì)，不耐熱，抗原存在于鞭毛中，蛋白質(zhì)，不耐熱，6060、30-60min30-60min及酒精作用均可破壞其抗原性，能抵抗甲醛。及酒精作用均可破壞其抗原性，能抵抗甲醛。ViVi抗原抗原：是一種：是一種N-N-乙酰乙酰-D-D-半乳糖胺糖醛酸聚合物，半乳糖胺糖醛酸聚合物，6060加熱加熱1h1h即破壞其凝集性和免疫原性。即破壞其凝集性和免疫原性。DHL:無色半透明有黑色中心或幾乎全為黑色酚紅黃綠：菌落呈紅色透明，同時培養(yǎng)基

5、顏色變紅HE：藍綠色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色科馬嘉顯色培養(yǎng)基：呈紫色或紫紅色沙門氏菌在不同選擇瓊脂平板上的菌落特征沙門氏菌傷寒和副傷寒急性腸胃炎敗血癥內(nèi)毒素對人的危害 據(jù)調(diào)查，沙門氏菌是美國食物中毒致死的主要原因。美國每年大約報告40000例沙門氏菌感染病例。但實際的感染人數(shù)可能要達20倍以上，因為許多輕型病人可能未確診，據(jù)不完全統(tǒng)計，每年大約1000人死于急性沙門氏菌感染。沙門氏菌對動物的危害 畜禽食用含有沙門氏菌的飼料，就可引起疾病或帶菌。一般情況下畜禽腸道帶菌率比較高。當(dāng)動物因患病、衰弱、營養(yǎng)不良、疲勞以致抵抗力降低時，腸道中的沙門氏菌即可經(jīng)腸系膜淋巴結(jié)和淋巴組織進入血液引起

6、全身感染，甚至死亡。（1）急性敗血癥 多見于斷奶前后（24月齡）仔豬，主要由豬霍亂沙門氏菌引起。發(fā)熱，拒食，耳根，胸前，腹下等處皮膚出現(xiàn)紫斑，后期見下痢，呼吸困難，咳嗽跛行，經(jīng)14d死亡。病死率可達2040。（2）亞急性和慢性 表現(xiàn)為：體溫升高，畏寒；結(jié)膜炎， 頑固性下痢，伴以消瘦，脫水而死；部分病豬在病中后期皮膚出現(xiàn)彌漫性濕疹。（1）雛雞感染：引起敗血癥，可造成大批死忙 ；病雞表現(xiàn)虛弱，口渴，食欲不振，腹瀉，發(fā)育遲滯等。（2）成年雞：最常見產(chǎn)蛋量降低或停止。另外可引起卵巢炎，可在卵黃內(nèi)帶菌而傳給幼雛。（1）犢牛：體溫升高，呼吸困難；排出血絲糞便；病期延長時，腕和跗關(guān)節(jié)可能腫大，有時伴有支氣管

7、炎和肺炎癥狀。（2）成年牛：常有高熱，昏迷，食欲廢絕，呼吸困難，體力迅速衰竭；懷孕母牛多數(shù)發(fā)生流產(chǎn)。傳播途徑最主要的傳播途徑是水、土壤和飼料病菌隨人和動物的糞尿等排泄物及病死畜禽來污染土壤和水源因宰殺患病、帶菌的畜禽而造成病菌的散布，致使健康動物的胴體和環(huán)境受到污染飼料和飲水的污染，是導(dǎo)致畜禽沙門氏菌病以及相互傳染的主要原因 危害程度分類 中華人民共和國衛(wèi)生部人間傳染的病原微生物名錄序號病原菌名稱危害程度分類實驗活動所需生物安全實驗室級別學(xué)名中文名大量活菌操作1 S a l m o n e l l a choleraesuis豬霍亂沙門菌第三類BSL-22Salmonella enterica

8、腸沙門菌第三類BSL-23Salmonella meleagridis火雞沙門菌第三類BSL-24Salmonella paratyphi A,B,C甲、乙、丙型副傷寒沙門菌第三類BSL-25Salmonella typhi傷寒沙門菌第三類BSL-26Salmonella typhimurium鼠傷寒沙門菌第三類BSL-2 加強飼料的衛(wèi)生管理，防止沙門氏菌的污染，不僅是發(fā)展畜禽生產(chǎn)的需要，也是減少人類感染沙門氏菌、預(yù)防食物中毒的一個重要環(huán)節(jié)。意義Torres G J等2011年對西班牙3844個飼料樣品檢測發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌的檢出率為4.8%美國對12個牛場的295份飼料樣品進行沙門氏菌檢測，檢出

9、率為9.8% 國外沙門氏菌污染情況傳統(tǒng)檢測方法 分子生物學(xué)方法免疫學(xué)方法常規(guī)沙門氏菌檢測技術(shù)國內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法免疫學(xué)方法傳統(tǒng)檢測方法GB/T13091-2002（培養(yǎng)法）GB/T 4789.4-2010（培養(yǎng)法）GB/T29642-2012（PCR法）SN/T 1059.7-2010（實時熒光PCR法）GB/T 22429-2008（酶聯(lián)免疫法）DB34/T816-2008（免疫色譜反應(yīng)法）傳統(tǒng)檢測方法前增菌選擇性增菌分離培養(yǎng)生化鑒定血清學(xué)鑒定傳統(tǒng)檢測方法原理沙門氏菌生化特性修復(fù)受損傷的沙門氏菌飼料中含大量雜菌主要培養(yǎng)基、試劑、血清 緩沖蛋白胨水（BPW） 氯化鎂-孔雀綠增菌液（RV）

10、 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC） 酚紅黃綠瓊脂 DHL瓊脂 營養(yǎng)瓊脂 色氨酸肉湯 賴氨酸脫羧酶肉湯 尿素酶 氰化鉀培養(yǎng)基 甘露醇 山梨醇 -半乳糖苷 沙門氏菌 O，Vi，H型血清主要儀器設(shè)備與材料高壓滅菌鍋干熱滅菌箱培養(yǎng)箱水浴鍋接種環(huán)培養(yǎng)瓶或三角瓶 量筒平皿25g樣品225ml BPW36 16-20h1ml BPW增菌液+10ml SCMM增菌液在42、SC增菌液在36各培養(yǎng)24h0.1ml BPW增菌液+10ml MM分別從MMMM和SCSC增菌液中取1環(huán)，接種到酚紅黃綠和DHL瓊脂上培養(yǎng)在36培養(yǎng)20-24hDHL瓊脂在36培養(yǎng)24h分別選擇性培養(yǎng)基上挑選可以菌落進行TSI等生化鑒定TSI

11、生化試驗底層產(chǎn)H2S底層產(chǎn)酸斜面產(chǎn)堿斜面底層產(chǎn)酸產(chǎn)堿底層產(chǎn)酸斜面產(chǎn)堿底層產(chǎn)H2S產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)H2S只在TSI產(chǎn)堿的情況下可判定無沙門氏菌，其余任何情況均需進行生化鑒定生化鑒定O.5個麥?zhǔn)蠞醾€麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙憾鹊木鷳乙阂来卧诿總€安瓿依次在每個安瓿瓶中滴加菌懸液瓶中滴加菌懸液23滴。滴。第一步第一步第二步第二步第三步第三步生化鑒定試劑套裝色氨酸肉湯經(jīng)36，1824h培養(yǎng)后滴加靛基質(zhì)試劑，片刻觀察結(jié)果，陽性為玫瑰紅色色氨酸脫羧酶及對照和氰化鉀及對照轉(zhuǎn)種結(jié)束后需滴加液體石蠟覆蓋試驗管方可進行培養(yǎng)靛基質(zhì)試驗+時補做甘露醇山梨醇試驗，試驗陽性后進行血清學(xué)鑒定TSI-時，進行ONPG試驗，ONPG陰性

12、時進行血清學(xué)鑒定H2S+、靛基質(zhì)- 、尿素-、KCN-、賴氨酸+后進行血清學(xué)鑒定結(jié)果判定 其他商品化生化鑒定系統(tǒng)其他商品化生化鑒定系統(tǒng)VITEK GNI+ 應(yīng)用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進行測試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質(zhì)。先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細菌的小卡上，將其放入具有讀數(shù)功能的孵箱內(nèi)，每隔一定時間，儀器會自動檢測培養(yǎng)基的發(fā)酵情況，并換算成能被計算機所接受的生物編碼。最后由計算機判定，打印出鑒定結(jié)果。VITEK6-8h商品化生化鑒定系統(tǒng)API 20E API 20E 生化鑒定是根據(jù)快速酶促反應(yīng)及代謝產(chǎn)物的檢測技術(shù)發(fā)展而來的一種細菌編碼鑒定法，廣泛應(yīng)

13、用于臨床、食品中革蘭氏陰性桿菌的快速鑒定。API 20E18-24hAPI 20E第第1位數(shù)位數(shù)第第2位數(shù)位數(shù)第第3位數(shù)位數(shù)第第4位數(shù)位數(shù)第第5位數(shù)位數(shù)第第6位數(shù)位數(shù)第第7位數(shù)位數(shù)結(jié)結(jié)果果判判定定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX1 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 4反應(yīng)反應(yīng)結(jié)果結(jié)果- + + + +- - - - + + + - +- + -沙沙門門氏氏菌菌應(yīng)得應(yīng)得數(shù)值數(shù)值0 2 41 2 40 0 0 0 0 41 2 41 0 40 2 0組合組合編碼編碼 6 7 0

14、 4 7 5 2BD PhoenixTM 1002-8h血清學(xué)鑒定 陰性 陽性 GB/T29642-2012 飼料中沙門氏菌的快速檢測方法-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法SN/T 1059.7-2010 進出口食品中沙門氏菌檢測方法-實時熒光PCR法現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)原理 PCR技術(shù)是是通過模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將DNA目的片段進行短時間內(nèi)大量擴增的技術(shù)。25g樣品225ml BPW36 16-20h1ml BPW增菌液+10ml SCRVS增菌液在41.5、SC增菌液在36各培養(yǎng)243h0.1ml +10ml 大豆蛋白胨肉湯（RVS）煮沸離心PCR擴增電泳檢測GB/T29642

15、-2012-主要儀器設(shè)備、培養(yǎng)基、試劑PCR儀離心機微量移液器電泳儀凝膠成像儀分析天平緩沖蛋白胨水大豆蛋白胨肉湯亞硒酸鹽胱氨酸增菌液引物Premix Taq DNA 聚合酶瓊脂糖Marker 2000TAE緩沖液溴化乙錠（EB）-GB/T29642-2012DNA模板制備方法方法一：熱裂解法 取選擇性增菌液1ml于離心管中，12000r/min離心10min，滅菌去離子水洗滌2次，最后用0.2ml滅菌去離子水懸浮，煮沸10min，將離心管迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻，10000r/min離心5min，取上清液作為模板。方法二：試劑盒 可選用商業(yè)試劑盒。-GB/T29642-2012PCR擴增 反應(yīng)體系

16、 反應(yīng)程序 -GB/T29642-2012PCR結(jié)果分析及判定結(jié)果判定：在陰性對照無條帶，陽性對照有條帶的前提下，如果待測樣品再330處未出現(xiàn)相應(yīng)大小的擴增條帶，則可報告未檢出沙門；如果待測樣品在330bp處出現(xiàn)擴增條帶，則為疑似陽性樣品，需用GB/T 13091進行確證，最終結(jié)果以后者為準(zhǔn)。-GB/T29642-2012實時熒光PCR原理實時熒光PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過陽性對照、Ct值及擴增曲線對模板進行定性分析的方法。25g樣品225ml BPW36 16-20h1ml BPW增菌液+10ml SCRVS增菌液在41.5、S

17、C增菌液在36各培養(yǎng)243h0.1ml +10ml 大豆蛋白胨肉湯（RVS）煮沸離心反應(yīng)體系擴增曲線實時熒光PCR法主要儀器設(shè)備、培養(yǎng)基、試劑 熒光定量PCR儀 離心機 微量移液器 恒溫水浴鍋 高壓滅菌鍋 緩沖蛋白胨水 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液 四硫磺酸鈉孔雀綠增菌液 引物 探針 DNA提取試劑盒 Taq DNA聚合酶-SN/T 1059.7-2010模板DNA的制備方法一：熱裂解法 取增菌液1ml，置于離心管中，5000r/min離心5min，滅菌生理鹽水洗滌2次，最后用1ml滅菌去離子水懸浮，煮沸15min，10000r/min離心5min，取上清液作為模板。方法二：試劑盒法 參照美國Prom

18、ega公司生產(chǎn)的DNA抽提試劑盒，或其他等效產(chǎn)品操作程序進行。-SN/T 1059.7-2010實時熒光PCR擴增反應(yīng)體系（25ul）反應(yīng)條件10PCR緩沖液2.5uldNTPs1ul上游引物1ul下游引物1ul探針1ul模板2ulTaq DNA 酶0.5ul雙蒸水16ul1個循環(huán)9510min40個循環(huán)9515s6530s-SN/T 1059.7-2010 樣品Ct值35時，報告沙門氏菌篩選陽性； 樣品Ct值介于35-40之間，重復(fù)一次，如果Ct值40，且曲線有明顯的對數(shù)增長期，報告沙門氏菌篩選陽性，否則，報告未檢出； 樣品Ct值40時，報告未檢出。 篩選陽性的樣品按SN0170的規(guī)定進行確證，以確證結(jié)果為準(zhǔn)。結(jié)果分析及判定-SN/T 1059.7-2010其他分子生物學(xué)技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）多重PCR技術(shù)基因芯片技術(shù)免疫學(xué)方法現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22429-2008食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗（酶聯(lián)免疫法）DB 34/T 816-2008飼料中沙門氏菌的測定（免疫色譜反應(yīng)法）技術(shù)原理 免疫學(xué)檢測是基于免疫學(xué)理論基礎(chǔ)，根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)而進行檢測的技術(shù)。 沙門氏菌特異性抗體是快速定性檢測的基礎(chǔ)。主要儀器設(shè)備、培養(yǎng)基、試劑酶聯(lián)免疫分析