[自然科學]第九章 蛋白質(zhì)的測定ppt課件

1、第九章第九章 蛋白質(zhì)的測定蛋白質(zhì)的測定王建龍王建龍食品科學與工程學院食品科學與工程學院第九章第九章 重點重點 凱氏定氮法原理、分步、測定方法。凱氏定氮法原理、分步、測定方法。 雙縮脲法測定原理。雙縮脲法測定原理。 氨基酸總量的測定方法甲醛滴定法。氨基酸總量的測定方法甲醛滴定法。一、概述1、食品中的蛋白質(zhì)含量 各種不同食品的蛋白質(zhì)含量各不一樣，普通動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。 食品中的蛋白質(zhì)含量食品中的蛋白質(zhì)含量(g/100g)牛肉 豬肉 兔肉 雞肉 20 9.5 21 20大豆 米 面粉 菠菜 蘋果 40 8.5 10 2.4 0.42、蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用3、蛋白質(zhì)系數(shù)

2、 蛋白質(zhì)是復雜的含氮有機化合物，普通蛋白質(zhì)含氮量為16，即一份氮素相當于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值6.25稱為蛋白質(zhì)系數(shù)，不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同。樣品蛋白質(zhì)系數(shù)樣品蛋白質(zhì)系數(shù)小麥粉及其制品5.70畜禽肉及其制品6.25全麥5.83芝麻5.30大米5.95乳類6.38花生5.46黃豆5.71二、測定方法蛋白質(zhì)測定方法凱氏定氮法蛋白質(zhì)快速測定法一凱氏定氮法一凱氏定氮法GB/T 5009.5-2003) 凱氏定氮法是經(jīng)過測出樣品中的總含氮量凱氏定氮法是經(jīng)過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的再乘以相應的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量，由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含量，由于樣品

3、中含有少量非蛋白質(zhì), ,用凱用凱氏定氮法經(jīng)過測總氮量來確定蛋白質(zhì)含量，氏定氮法經(jīng)過測總氮量來確定蛋白質(zhì)含量，包含了核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉、包含了核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白質(zhì)含氮化合物，以及含氮色素等非氮蛋白質(zhì)含氮化合物，所以這樣的測定結果稱為粗蛋白。所以這樣的測定結果稱為粗蛋白。The Kjeldahl Procedure凱氏法的程序凱氏法的程序 1. Digestion step消化2. Distillation step蒸餾3. Titration step滴定1、原理 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+1

4、6H2O 消化 (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O 蒸餾滴定 4225)(5)(423342742427424333BOHClNHHClOHOBNHOHOBNHBOHNH濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水后被炭化為碳、氫、濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又具有氧化性氮。濃硫酸又具有氧化性,將有機物炭化后的碳化為二將有機物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸那么被復原成二氧化硫。氧化碳，硫酸那么被復原成二氧化硫。 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO22、儀器凱氏燒瓶、可調(diào)式電爐、蒸汽蒸餾安裝3、試劑1硫酸銅CuSO45H2O；2硫酸鉀；3濃硫酸:

5、密度為1.8419 g/L4氫氧化鈉溶液:400g/L5)硼酸溶液:20g/L6 6 0.05 mol 0.05 molL L鹽酸規(guī)范滴定溶液鹽酸規(guī)范滴定溶液 7 795%95%乙醇。乙醇。8 8混合指示液混合指示液:1:1份甲基紅乙醇溶液份甲基紅乙醇溶液(1 g/L)(1 g/L)與與5 5份溴甲酚綠乙醇溶液份溴甲酚綠乙醇溶液(1 g/L)(1 g/L)臨用時混合。也可臨用時混合。也可用用2 2份甲基紅乙醇溶液份甲基紅乙醇溶液(1 g/L)(1 g/L)與與1 1份亞甲基藍乙份亞甲基藍乙醇溶液醇溶液(1 g/L)(1 g/L)臨用時混合。臨用時混合。甲基紅-溴甲酚綠 pH 5.0 以下為暗紅

6、色，pH 5.1 為灰綠色， pH 5.2 以上為綠色。 甲基紅-亞甲基藍混合指示液： 變色點pH=5.4，5.2紅紫5.4灰藍5.6綠， 4、操作方法 樣品消化蒸餾滴定1樣品消化樣品+0.2g硫酸銅+6g硫酸鉀+20ml濃硫酸+玻珠數(shù)粒先小火炭化，無泡沫后，加大火力，液體變藍綠透明，繼續(xù)加熱微沸30分鐘45度角消化終點瓶口不能對著人蓋上小漏斗2 2蒸餾蒸餾按以下圖銜接好蒸餾安裝圖加水至2/3體積處，加數(shù)滴甲基橙指示劑和硫酸幾毫升，使水呈酸性夾緊螺旋夾加熱蒸汽發(fā)生瓶中的水，檢查整套安裝能否有漏氣景象，不能漏氣。水蒸氣與生成的氨氣共沸，不斷移除氨氣，使反響繼續(xù)。2 2蒸餾蒸餾將消化液全部轉移到1

7、00ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示劑23d參與NaOH溶液后顏色為深藍色或褐色通入蒸汽開場蒸餾冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀釋液沿小玻璃杯移入反響室，少量蒸餾水沖洗，塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內(nèi)參與10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH緩慢流入反響室，立刻塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。吸收液變藍色后繼續(xù)蒸餾5分鐘，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端，取下接納瓶，封鎖電源3 3滴定滴定 取下接納瓶，用取下接納瓶，用0.1000mol/L0.1000mol/L的鹽酸或硫的鹽酸或硫酸規(guī)范溶液滴定至灰色或藍紫色為終點。酸規(guī)范溶液滴定至灰色或

8、藍紫色為終點。滴定前滴定終點同時做一試劑空白實驗，記錄空白滴定耗費鹽酸的體積。5、計算10010010014. 0)(=%2-1FmVVc）蛋白質(zhì)（0.014表示表示1.0鹽酸規(guī)范滴定溶液相當?shù)暮葵}酸規(guī)范滴定溶液相當?shù)暮縁表示蛋白質(zhì)系數(shù)表示蛋白質(zhì)系數(shù)計算結果保管三位有效數(shù)字計算結果保管三位有效數(shù)字6、闡明及本卷須知1 試劑溶液運用無氨蒸餾水配制2消化時不要用強火，應堅持緩和沸騰，消化中不時轉動凱氏燒瓶，以便冷凝酸液洗下附在瓶壁上的固體殘渣，促進其消化完全。3為加速消化，常參與 硫酸鉀：可提高消化體系溶液溫度 硫酸銅：催化劑、消化終點指示劑、蒸餾時堿性反響指示劑硫酸鉀的作用硫酸鉀的作用

9、參與硫酸鉀可以提高溶液的沸點而加快有機物的分解，它與硫酸參與硫酸鉀可以提高溶液的沸點而加快有機物的分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反響溫度其反響式如下：作用生成硫酸氫鉀可提高反響溫度其反響式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3普通純硫酸的沸點在普通純硫酸的沸點在340340攝氏度左右，而添加硫酸鉀后，可使溫攝氏度左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到度提高到4000C4000C以上，緣由主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分以上，緣由主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地

10、被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大 ，故沸點升高。，故沸點升高。但硫酸鉀參與量不能太大，否那么消化體系溫度過高，又會引起但硫酸鉀參與量不能太大，否那么消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而呵斥損失：已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而呵斥損失： NH4NH42SO4=NH3+(NH4)HSO42SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O硫酸銅的作用硫酸銅的作用 催化劑催化劑 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 CO2+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2

11、 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反響不斷進展，待有機物被消化完后，此反響不斷進展，待有機物被消化完后，不再有硫酸亞銅褐色生成，溶液呈現(xiàn)不再有硫酸亞銅褐色生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色。清澈的藍綠色。 可以指示消化終點的到達可以指示消化終點的到達 下一步蒸餾時作為堿性反響的指示劑。下一步蒸餾時作為堿性反響的指示劑。4樣品中假設含較多脂肪或糖，在開場消化時運用小火加熱，并時時搖動；或者參與少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時留意控制熱源強度。5當樣品消化液不易廓清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，參與30%過氧化氫23ml后再繼續(xù)加熱消化。 6假設取樣量較大，如干試樣超越5g

12、，可按每克試樣5ml的比例添加硫酸用量。 7普通消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，普通消化時間約4小時，時間延伸能夠引起氨的損失。有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。 8蒸餾安裝不能漏氣9蒸餾前假設加堿量缺乏，消化液呈藍色不生成氫氧化銅沉淀，需再添加氫氧化鈉用量10硼酸吸收液的溫度不應超越40，否那么對氨的吸收作用減弱，置于冷水浴中運用。11蒸餾終了后，應先將冷凝管下端提離液面,清洗管口，再蒸1分鐘后關掉熱源，否那么能夠呵斥吸收液倒吸。7、自動凱氏定氮儀法 在凱氏定氮法的根底上開展起來的自動凱氏定氮儀法，具有平安、高效、準確的優(yōu)點。儀器：消化爐自動蒸餾安裝FO

13、SS 產(chǎn)品線產(chǎn)品線化學分析儀器化學分析儀器化學分析類儀器：化學分析類儀器：Kjeltec系列定氮儀系列定氮儀FOSS 產(chǎn)品線產(chǎn)品線化學分析儀器化學分析儀器化學分析類儀器：化學分析類儀器：Tecator系列消化系列消化器器Digestion Blocks消化爐Auto 20 and Auto 8250/400ml. 和100ml. Basic 20 and Basic 8250/400ml和100mlNewAuto 40100mlLift, Exhaust Manifold and Scrubber消化爐、升降安裝、排廢罩和滌氣安裝消化爐、升降安裝、排廢罩和滌氣安裝New generation

14、of Kjeltec Systems新一代凱氏定氮儀新一代凱氏定氮儀-前所未有的智能化系統(tǒng)！前所未有的智能化系統(tǒng)！ 8200 8400半自動半自動 -到到- 全自動全自動8100 8400/8420或或8460NewKjeltecTM 8100 凱氏定氮儀自動添加稀釋液和堿，自動進展蒸餾和終了蒸餾，自動進展消化管排空，操作簡便。專利的SAfE*技術保證在消化管中有酸/鹽結晶時的平安蒸餾。 內(nèi)置的平安系統(tǒng)保證操作者的平安。 餾出液的溫度控制系統(tǒng)保證分析結果準確可靠。 風箱泵準確添加試劑，保證準確性。KjeltecTM 8200 凱氏定氮儀包含KjeltecTM 8100 一切的特征，另加：自動添

15、加接納液自動平安門可添加模塊晉級到全自動凱氏定氮儀KjeltecTM 8400 全自動凱氏定氮儀包括 KjeltecTM 8200的一切特征，外加： 滴定、計算和報告?？蓵x級和20或60位自動進樣器連用，進展無人值守的全自動化操作。局域網(wǎng)銜接方式可以和打印機及天平進展無妨礙銜接。彩色觸摸屏。經(jīng)過可選計算機數(shù)據(jù)管理軟件Compass實現(xiàn)完全由計算機控制樣品注冊和報告。KjeltecTM 8420 自動進樣器20位自動進樣器，可包容一個20位消化管架250ml和400ml消化管都可用于系統(tǒng)將消化管架直接裝入進樣器，不需求轉移消化管或消化好的樣品KjeltecTM 8460 自動進樣器 60位自動進

16、樣器，可包容3個20位消化管架 250ml和400ml消化管都可用于系統(tǒng) 將消化管架直接裝入進樣器，不需求轉移消化管或消化好的樣品KjeltecTM 自動進樣器可選20 & 60位進樣器直接將消化管架放入，不需轉移消化管或轉移樣品250 ml和 400 ml管都可用于系統(tǒng)Kjeltec 8400 自動定氮儀可以直接晉級Kjeltec 8200 也可以晉級到加進樣器的分析系統(tǒng)Kjeltec 8420Kjeltec 8460其它廠家的不能晉級或不能直接晉級其它廠家的不能晉級或不能直接晉級銜接進樣器，且需轉移消化管或消化銜接進樣器，且需轉移消化管或消化管內(nèi)的樣品管內(nèi)的樣品儀器性能丈量范圍：0

17、.1 - 200 mg N 檢測時間： 30mg N 用時3.5 分鐘 /200mg N 用時6.5分鐘 回收率： 99.5%，1-200mg N 范圍 重現(xiàn)性： RSD 1% 滴定器精度： 2.4ul/步試劑泵體積：0-150ml，10ml步進數(shù)據(jù)存儲：單機40個批次800個數(shù)據(jù)，Compass軟件無限進樣器：20位/60位二蛋白質(zhì)快速測定法雙縮脲法 紫外分光光度法 染料結合法 水楊酸比色法 1.雙縮脲法 1 1反響原理反響原理 1 1原理原理 當脲被小心地加熱至當脲被小心地加熱至150150160160時，可時，可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成二由兩個分子間脫去一個氨分子而生成二縮脲也叫

18、雙縮脲，反響如下：縮脲也叫雙縮脲，反響如下：150 160222223H NCONH +H-N(H)-CONHH NCONHCONH +NH C 雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反響稱為雙縮脲反響：2 2方法特點及運用范圍方法特點及運用范圍 由于蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵-CO-NH-，與雙縮脲構造類似，故也能呈現(xiàn)此反響而生成紫紅色配合物，在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸收光度法來測定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長為560nm 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學領域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法。 本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測

19、定。3 3操作方法操作方法規(guī)范曲線的制造規(guī)范曲線的制造按蛋白質(zhì)含量按蛋白質(zhì)含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg 分別稱取混合均勻的規(guī)范蛋白質(zhì)分別稱取混合均勻的規(guī)范蛋白質(zhì)8 支支50mL 納氏比納氏比色管中色管中各參與各參與1mL 四氯化碳四氯化碳用堿性硫酸銅溶液準確稀用堿性硫酸銅溶液準確稀釋至釋至50mL振搖振搖10min靜置靜置1h取上層清液離心取上層清液離心5min取離心分別后的透明液取離心分別后的透明液于比色皿中于比色皿中以蒸餾水作參比液調(diào)理儀器零點并測以蒸餾水作參比液調(diào)理儀器零點并測定各溶液的吸光度定各溶液的吸光度A560nm 波長蛋白

20、質(zhì)的含量為橫坐標，吸蛋白質(zhì)的含量為橫坐標，吸光度光度A 為縱坐標繪制規(guī)范曲為縱坐標繪制規(guī)范曲線。線。以采用凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量的樣以采用凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量的樣品作為規(guī)范蛋白質(zhì)樣品作為規(guī)范蛋白質(zhì)樣樣品的測定樣品的測定 準確稱取樣品適量即使得蛋白質(zhì)含量在40110mg 之間于50mL納氏比色管中，加1mL 四氯化碳，按上述步驟顯色后，在一樣條件下測其吸光度A。用測得的A 值在規(guī)范曲線上即可查得蛋白質(zhì)毫克數(shù)，進而由此求得樣品中的蛋白質(zhì)含量。4 4結果計算結果計算100/100 )cmggm蛋白質(zhì)（式中 c由規(guī)范曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg； m樣質(zhì)量量，g。5 5闡明及本卷須知闡明及本卷須

21、知 蛋白質(zhì)的種類不同，對發(fā)色程度影響不大。 規(guī)范曲線制造完好后，無需每次再作規(guī)范曲線。 含脂肪高的樣品應預先用醚抽出棄去。 樣品中有不溶性成分存在時，會給比色測定帶來困難，此時可預先將蛋白質(zhì)抽出后再進展測定。 當肽鏈中含有脯氨酸時，假設有多量糖類共存，那么顯色不好，會使測定值偏低。 堿性硫酸銅溶液由0.1mol 氫氧化鉀、5g 酒石酸鉀鈉、1.6g 硫酸銅溶于水后加水至1000mL 配成。2.2.福林福林- -酚比色法酚比色法原理原理蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)( (或多肽或多肽) )分子中含有酪氨酸或色氨酸分子中含有酪氨酸或色氨酸, ,能與能與Folin-Folin-酚試劑起氧化復原反響酚試劑起氧化復原反響

22、, ,生成藍生成藍色化合物色化合物, ,藍色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比藍色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比, ,可用比色法測定蛋白質(zhì)濃度可用比色法測定蛋白質(zhì)濃度. . 是檢測可溶是檢測可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。 測定測定 汲取一定量的樣品稀釋液，參與試劑汲取一定量的樣品稀釋液，參與試劑甲，置于甲，置于2525中水浴保溫中水浴保溫10min10min，再參，再參與試劑乙，立刻混勻，保溫與試劑乙，立刻混勻，保溫30min30min，以，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測定介質(zhì)溶液調(diào)零，測定A750nm A750nm 值，與蛋值，與蛋白質(zhì)規(guī)范液作對照，求出樣品的蛋白白質(zhì)規(guī)范液作對

23、照，求出樣品的蛋白質(zhì)的含量。質(zhì)的含量。 本法在本法在0 060mg/L 60mg/L 蛋白質(zhì)范圍呈良好蛋白質(zhì)范圍呈良好線性關系。線性關系。3.3.考馬斯亮藍染料比色法考馬斯亮藍染料比色法 原理原理 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G G250 250 是一種蛋白質(zhì)染料，與是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)經(jīng)過范德華引力結合，使蛋白質(zhì)染蛋白質(zhì)經(jīng)過范德華引力結合，使蛋白質(zhì)染色，在色，在620nm 620nm 處有最大吸收值，可用于蛋處有最大吸收值，可用于蛋白質(zhì)的定量測定。此法簡單而快速，適宜白質(zhì)的定量測定。此法簡單而快速，適宜大量樣品的測定，靈敏度與福林酚法類似，大量樣品的測定，靈敏度與福林酚法類似，但不受酚類、游離

24、氨基酸和小分子的影響。但不受酚類、游離氨基酸和小分子的影響。 測定測定 汲取樣品稀釋液汲取樣品稀釋液2mL2mL，加染料試劑，加染料試劑2mL2mL，混，混勻，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測定勻，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測定A620nmA620nm，與蛋，與蛋白質(zhì)規(guī)范溶液對照，求出樣品蛋白質(zhì)含量。白質(zhì)規(guī)范溶液對照，求出樣品蛋白質(zhì)含量。 本法在本法在0 0100mg/L 100mg/L 蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關系。線性關系。氨基酸態(tài)氮的測定雙指示劑甲醛滴定法：原理、試劑、測定方法、結果計算、闡明電位滴定法：原理、試劑、儀器、測定方法、結果計算三氨基酸態(tài)氮的測定三氨基酸態(tài)氮的測定1.雙指示劑甲醛

25、滴定法雙指示劑甲醛滴定法原理原理 氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當參與甲醛溶液時，中性的內(nèi)鹽。當參與甲醛溶液時，-NH2基與甲醛結合，從而使其堿性消逝。這基與甲醛結合，從而使其堿性消逝。這樣就可以用強堿規(guī)范溶液來滴定樣就可以用強堿規(guī)范溶液來滴定-COOH基，并用間接的方法測定氨基酸的總量?；?，并用間接的方法測定氨基酸的總量。RCHH3N CCOR CCOHOHNH2+HCHORCCOOHHN CH2+NaOHRCH COONaNCH2 (2) 操作方法操作方法 移取含氨基酸約移取含氨

26、基酸約2030mg的樣品溶的樣品溶液液2份，分別置于份，分別置于250ml錐形瓶中，各加錐形瓶中，各加50ml 蒸餾水，其中蒸餾水，其中1份參與份參與3滴中性紅指示滴中性紅指示劑，用劑，用0.1mol/L氫氧化鈉規(guī)范溶液滴定至由氫氧化鈉規(guī)范溶液滴定至由紅變?yōu)榧t變?yōu)?琥珀琥珀 色為終點；另色為終點；另1份參與份參與3滴百里滴百里酚酞指示劑及中性甲醛酚酞指示劑及中性甲醛20ml，搖勻，靜置，搖勻，靜置1分鐘，用分鐘，用0.1ml/L氫氧化鈉規(guī)范溶液滴定至氫氧化鈉規(guī)范溶液滴定至淡藍色為終點。分別紀錄兩次所耗費的堿液淡藍色為終點。分別紀錄兩次所耗費的堿液ml數(shù)。數(shù)。式中 c 氫氧化鈉規(guī)范溶液的濃度，mol/L; V1用中性紅作指示劑滴定時耗費氫氧化鈉規(guī)范溶液的體積，mL; V2用百里酚酞作指示劑滴定時耗費氫氧化鈉規(guī)范溶液的