第三章-分子雜交與印跡技術(shù)

1、2021/8/141第三章第三章 分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)2021/8/142 一、變性與復(fù)性一、變性與復(fù)性 （一）變性（一）變性 1、定義：在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵、定義：在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團，雙鏈解鏈成斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團，雙鏈解鏈成為單鏈。為單鏈。第一節(jié)第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交的基本原理2021/8/1432、變性的方法：、變性的方法：（1）熱變性：熱變性：溫度升高到溫度升高到90100時，雙鏈核酸時，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性酸堿變性：pH值低于值低

2、于3或高于或高于10時，雙鏈核時，雙鏈核 酸分子鏈酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。間的氫鍵斷裂。 （3）化學(xué)試劑變性化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。2021/8/1443、變性后的理化性質(zhì)變化：、變性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低粘度降低 密度增加密度增加 紫外吸收值增加紫外吸收值增加2021/8/1454、DNA變性曲線變性曲線 AT區(qū)先解鏈區(qū)先解鏈 GC區(qū)后解鏈區(qū)后解鏈 階梯式曲線階梯式曲線2021/8/1465、GC含量與含量與Tm值之間的關(guān)系值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =

3、(G+C)%0.41+69.32021/8/147（二）復(fù)性（二）復(fù)性 1、定義定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。性或雜交。具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸和寡核苷酸/RNA。2021/8/1482、復(fù)性過程、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離）

4、局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子）形成完整的雙鏈分子2021/8/1493、復(fù)性的速率方程（服從二級反應(yīng)動力學(xué)）、復(fù)性的速率方程（服從二級反應(yīng)動力學(xué)）dC dt=K2C2（1）將（1）積分C Co 1 1+K2Cot=（2）一半單鏈一半單鏈DNA分子復(fù)性時，（分子復(fù)性時，（2）式中的）式中的 為為1 21 2 1 1+K2Cot=Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢值越大，復(fù)性速度越慢C Co（3）1 K2Cot1/2=2021/8/1410二、分子雜交 將任何具有互補核苷酸順

5、序的兩條單鏈核酸分子放入同一個反應(yīng)體系，兩條互補鏈可通過復(fù)性重新締合形成雙鏈，這一過程成為核酸分子雜交。2021/8/1411三、探針三、探針（一）探針的種類（一）探針的種類 基因組基因組DNA探針探針 cDNA探針探針 RNA探針探針 寡核苷酸探針寡核苷酸探針探針：是指帶有標記物的、能與被檢測的核酸片段互補的一段已知核酸片段。2021/8/1412（二）（二） 探針的制備方法探針的制備方法制備方法：制備方法： (1) DNA重組技術(shù)重組技術(shù) (2) PCR擴增擴增 (3) 化學(xué)合成化學(xué)合成2021/8/1413合成寡核苷酸探針注意原則合成寡核苷酸探針注意原則(1) (1) 長度（長度（50-

6、300 bp); 50-300 bp); (2) G:C(2) G:C對含量對含量40%-60%40%-60%；(3) (3) 探針內(nèi)避免互補；探針內(nèi)避免互補；(4) (4) 避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5) (5) 與非靶序列有與非靶序列有70%70%以上同源性或連續(xù)以上同源性或連續(xù)8 8個以上堿基序列個以上堿基序列 相同，最好不用。相同，最好不用。2021/8/1414（三）標記物（三）標記物 1.想標記物應(yīng)具備的特性：想標記物應(yīng)具備的特性： 高度靈敏性高度靈敏性 不影響堿基配對的特異性不影響堿基配對的特異性 不影響探針分子的主要理化性質(zhì)不影響探針分子的主要理化性質(zhì) 對酶

7、促反應(yīng)活性無影響或影響不大對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大 檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性2021/8/14152. 標記物種類標記物種類 核素標記物：核素標記物：32p、35s、3H 非核素標記物非核素標記物 半抗原：生物素、地高率半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學(xué)發(fā)光探針：標記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光探針：標記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光， 如生物素酰化的堿性磷酸酶如生物素?；膲A性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光可使發(fā)光底物發(fā)光 2021/8/141

8、6（四）標記方法（四）標記方法 體內(nèi)標記法：體內(nèi)標記法：將核素標記的化合物作為合成將核素標記的化合物作為合成代謝的底物，在細胞合成代謝時使代謝的底物，在細胞合成代謝時使 核素摻入到新核素摻入到新合成的核酸分子中，如合成的核酸分子中，如3H-胸苷可摻入到胸苷可摻入到DNA中，中， 3H-尿苷可摻入到尿苷可摻入到RNA中中 2021/8/1417體外標記法：體外標記法： 化學(xué)標記法：標記物分子上的活性基因與化學(xué)標記法：標記物分子上的活性基因與 探針分子上的某些基因反應(yīng)，探針分子上的某些基因反應(yīng)， 標記物直接結(jié)合到探針分子上標記物直接結(jié)合到探針分子上 酶促標記法：標記物預(yù)先標記核苷酸，然酶促標記法：

9、標記物預(yù)先標記核苷酸，然 后利用酶促法將標記的核苷酸后利用酶促法將標記的核苷酸 摻入到探針上摻入到探針上2021/8/1418酶促標記法酶促標記法1.切口平移法（切口平移法（nick translation)1、利用、利用DNase I在在DNA雙鏈上造成單鏈切口雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌、利用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的53 核酸外核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從切酶活性在切口處將舊鏈從5 末端逐步切除末端逐步切除3、在、在DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以互補的互補的DNA單鏈為模板依次將單鏈為模板依次將dNTP連接到切連接到切口的口的3 末端末端-O

10、H上，合成新的上，合成新的DNA鏈，同時鏈，同時將標記的核苷酸摻入到新的將標記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中鏈中2021/8/14192021/8/14202.隨機引物法隨機引物法 其原理是隨機引物能與各種單鏈其原理是隨機引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，聚合酶的催化下，按按53 方向合成一新的方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與鏈，其核苷酸序列與模板模板DNA完全互補。完全互補。 另一單鏈另一單鏈DNA模板同樣合成一條新的完全互模板同樣合成一條新的完全互補的補的DNA鏈。合成時，帶放射性核素標記的核苷鏈。合成時，帶放射

11、性核素標記的核苷酸摻入到新合成的酸摻入到新合成的DNA分子中分子中2021/8/14212021/8/1422隨機引物法所具有的優(yōu)點：隨機引物法所具有的優(yōu)點：1、能進行雙鏈、能進行雙鏈DNA、單鏈、單鏈DNA或或RNA探針的標記探針的標記2、操作簡單方便，避免因、操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不處理濃度掌握不當所帶來的一系列問題當所帶來的一系列問題3、標記活性高，標記活性可達、標記活性高，標記活性可達108cpm/gDNA以以上上4、可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進行標記、可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進行標記2021/8/14233. PCR標記法：標記法：將標記的核苷酸作為將標記的核

12、苷酸作為PCR反應(yīng)的底物，以待標記反應(yīng)的底物，以待標記的的DNA為模板，經(jīng)為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，標記的核苷酸摻入反應(yīng)，標記的核苷酸摻入到新合成的到新合成的DNA分子中分子中2021/8/14242021/8/1425 三、影響雜交的因素三、影響雜交的因素 1、探針分子的濃度和長度：、探針分子的濃度和長度： 濃度越大，復(fù)性速度越快濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g,濃度過高影響雜濃度過高影響雜 交效率交效率2021/8/14262、溫度：、溫

13、度： （1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較雜交，適宜溫度較Tm值低值低2025 （2）RNA/DNA或或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低雜交，加甲酰胺降低 Tm值值 （3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低值低5 2021/8/14273、離子強度：、離子強度： （1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加交率增加 （2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的

14、鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 2021/8/14284、甲酰胺：、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸雜交的）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待測核酸與探針同源性不高時，加測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542 雜交雜交 （2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在液在68雜交雜交 2021/8/14295、核酸分子的復(fù)雜性：、核酸分子的復(fù)雜性： （1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)

15、體系中不同順序）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度的總長度 （2）復(fù)性速率與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成反比）復(fù)性速率與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成反比 （3）兩個）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性的相對復(fù)雜性 2021/8/14306、非特異性雜交反應(yīng)：、非特異性雜交反應(yīng)： （1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類：即非特異性）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分和高分子化合物。如鮭精子化合物。如鮭精

16、DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉溶液或脫脂奶粉 2021/8/1431 四、應(yīng)四、應(yīng) 用用1.1.檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關(guān)系；檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關(guān)系；2.2.用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達豐度。數(shù)及表達豐度。 2021/8/1432按待測核酸是否固定在固相支持物上分：按待測核酸是否固定在固相支持物上分： 固固-液相雜交液相雜交印跡雜交印跡雜交原位雜交原位雜交液相雜交液相雜交按照雜交分子特性分按照雜交分子特性分DNA-DNA雜交雜交DNA-RNA雜交雜交蛋白質(zhì)雜交蛋白

17、質(zhì)雜交第二節(jié)第二節(jié) 核酸分子雜交的方法核酸分子雜交的方法2021/8/1433一、一、Southern印跡雜交印跡雜交此技術(shù)由此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計。被檢測對象為年首先設(shè)計。被檢測對象為DNA。2021/8/1434帶有帶有DNA片段的凝膠片段的凝膠DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳至至膜（尼龍膜或硝酸膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）纖維素濾膜）上上轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜雜交、顯影雜交、顯影凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移用緩沖液轉(zhuǎn)移DNADNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern Southern 印跡雜交的技術(shù)流程印跡雜交的技術(shù)流程20

18、21/8/1435（一）待測核酸樣品的制備（一）待測核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細胞、裂解或破碎細胞 2、抽取純化基因組、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化、限制酶消化DNA為大小不同的為大小不同的DNA片段片段2021/8/1436（二）待測（二）待測DNA樣品的電泳分離樣品的電泳分離 1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠分離小片段用高濃度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動慢泳動慢,小分子小分子DNA泳動快，泳動快， 大小大小 相同的分子處于同一條帶相同的分子處于同一條帶

19、3、分子量標準：經(jīng)、分子量標準：經(jīng)Hind消化的消化的DNA，雜交，雜交 所用分子量標準可用核素標記所用分子量標準可用核素標記 2021/8/1437（三）凝膠中核酸的變性（堿變化）（三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于凝膠置于NaOH溶液中使溶液中使DNA變性斷裂為較短的變性斷裂為較短的 單鏈單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 2021/8/1438（四）（四）Southern印跡印跡 指將電泳分離的指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程相支持物上的過程2021/8/14391、固相支持物的選擇、固相支持物的選擇（1

20、）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強結(jié)合核酸分子的能力具有較強結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng)不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機械性能具有良好的機械性能 非特異吸附少非特異吸附少2021/8/1440（2）常用的固相支持物）常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本 底低。缺點是底低。缺點是DNA分子結(jié)合不牢固分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸的能力比硝酸 纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高

21、纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高 化學(xué)活化膜：優(yōu)點：化學(xué)活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共價結(jié)合；對不同與膜共價結(jié)合；對不同 大小的大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能 力較上述兩種膜低力較上述兩種膜低2021/8/14412、Southern印跡的常用方法印跡的常用方法 （1）毛細管虹吸印跡法）毛細管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬和檸檬酸鈉，上層吸水紙

22、的虹吸作用使緩沖液通過濾酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝片段垂直向上運動，凝膠中的膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上片段移出凝膠而滯留在膜上2021/8/1442。2021/8/1443（2）電轉(zhuǎn)法）電轉(zhuǎn)法利用電場的電泳作用將凝膠中的利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相轉(zhuǎn)移到固相支持物上。支持物上。2021/8/14442021/8/1445（3）真空轉(zhuǎn)移法）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾此法原理與毛細管虹吸法相同，只

23、是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上?；蛳跛崂w維素膜上。2021/8/14462021/8/1447 （五）（五）Southern雜交雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液探針的雜交液 2、雜交：液相中的、雜交：液相中的D

24、NA探針與膜上的待測探針與膜上的待測DNA雜交雜交 雙鏈雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA 2021/8/1448（六）雜交結(jié)果檢測（六）雜交結(jié)果檢測 1、放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針、放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針 2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針2021/8/1449（七）（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量、特定基

25、因定性和定量 3、基因突變分析、基因突變分析 4、限制性片段長度多態(tài)性的分析、限制性片段長度多態(tài)性的分析2021/8/1450二、二、Northern印跡雜交印跡雜交 1、基本原理和基本過程與、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同基本相同 2、鑒別、鑒別RNA 3、探針可用、探針可用DNA或或RNA片段片段 4、待測樣品為總、待測樣品為總RNA或或mRNA2021/8/1451Northern印跡與印跡與Southern 印跡的不同點印跡的不同點 1、變性：、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持持RNA處于變性狀態(tài)，處于變性狀態(tài)，D

26、NA電泳前和電泳電泳前和電泳 中不變性中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時，印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理 3、靶核酸為、靶核酸為RNA2021/8/1452三、三、 Western印跡雜交印跡雜交 將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體抗體-抗原抗原”免疫免疫反應(yīng)或反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。質(zhì)。2021/8/1453四、斑點及狹縫

27、印跡雜交四、斑點及狹縫印跡雜交 1、斑點印跡為圓形、斑點印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀、狹縫印跡為線狀 3、鑒別、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量、特異性不高、不能鑒別核酸分子量2021/8/1454五、原位雜交五、原位雜交1、定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中、定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；交；根據(jù)探針與待檢核酸分：根據(jù)探針與待檢

28、核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 雜交；雜交；根據(jù)雜交物分為菌落、噬菌斑及真核細胞原位雜交。根據(jù)雜交物分為菌落、噬菌斑及真核細胞原位雜交。2021/8/1455 保持組織細胞的形態(tài)保持組織細胞的形態(tài) 對核酸無抽提，修飾與降解作用對核酸無抽提，修飾與降解作用 不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位 不阻礙核酸與探針的雜交過程不阻礙核酸與探針的雜交過程 對雜交信號無遮蔽作用對雜交信號無遮蔽作用 理化性質(zhì)穩(wěn)定理化性質(zhì)穩(wěn)定 2、雜交過程：、雜交過程：（1）組織或細胞的固定）組織或細胞的固定 理想固定液應(yīng)具備：理想固定液應(yīng)具備：2021/8/1456（2）組織細胞

29、雜交前的預(yù)處理）組織細胞雜交前的預(yù)處理 去垢劑（如去垢劑（如Triton x-100和和SDS）和蛋白酶）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質(zhì)去除核酸表面的蛋白質(zhì) 組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 控制消化時間，避免細胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載?？刂葡瘯r間，避免細胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻 片上脫落片上脫落2021/8/1457（3）探針的選擇與標記）探針的選擇與標記 以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針 探針的長度一般為探針的長度一般為50300bp ,有時達有時達1.5kb 放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定放射

30、性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長 非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于觀察于觀察2021/8/1458（4）雜交）雜交 雜交液體積?。弘s交液體積?。?020l cDNA和和RNA探針雜交溫度約為探針雜交溫度約為50 雜交時間雜交時間:DNA探針雜交為探針雜交為24h.RNA探針雜交過夜探針雜交過夜 雜交前一般將組織切片置雜交前一般將組織切片置95 515分鐘使分鐘使DNA變性變性 沖洗溫度一般沖洗溫度一般 不超過不超過50 2021/8/1459（5）雜交結(jié)果檢測）雜交結(jié)果檢測 所用探針為核素標記所用探針為核素標記,放射自顯影檢測放射自顯影檢測 所用探針為非核素標記所用探針為非核素標記,比色或化學(xué)發(fā)光檢測比