褪黑素對大鼠脊髓損傷后iNOS表達的影響

1、褪黑素對大鼠脊髓損傷后iNOS表達的影響 作者：李東 武永剛 趙爾曼 楊秀玲 段力軍【摘要】 目的：探討褪黑素對大鼠脊髓損傷后誘生型一氧化氮合酶 (iNOS)表達的影響。方法：采用改良 Allens撞擊法制備脊髓損傷模型；成年SD大鼠110只隨機分為假損傷組、損傷組和藥物治療組3組，其中損傷組和藥物治療組各50只，分5個時間點（8小時、24小時、72小時、7天、14天）處死；假損傷組10只，于手術(shù)后14天處死，采用HE染色和免疫組化檢測脊髓損傷后脊髓組織中 iNOS蛋白的表達。結(jié)果：與損傷組比較,藥物治療組大鼠損傷后脊髓組織 iNOS表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P0.05)。結(jié)論：褪黑素

2、可通過抑制 iNOS蛋白表達對大鼠脊髓損傷起保護作用。 【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷;褪黑素;誘生型一氧化氮合酶 Abstract Objective：To investigate the influence of Melatonin on the induction of inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in spinal cord upon spinal cord injury (SCI) in rats. Methods:SCI model was reproduced according to Allens method wi

3、th modification. One hundred and ten adult SD rats were randomly divided into three groups: sham injury group (n=10), the spinal cord injured group (n=50), and SCI with melatonin treatment group (n=50). For the SCI groups with or without melatonin treatment, rats were killed at different time (8h, 2

4、4h, 72h, 7d, 14d). And rats of sham injury group were killed at 14d post SCI operation. HE staining and Immunohistochemistry method were employed to detect iNOS expression in spinal cord. Results:Melatonin treatment significantly reduces the induction of iNOS expression in spinal cord of rats subjec

5、ted to SCI operation(P<0.05 or 0.01). Conclusion:The result suggests that melatonin may exert protective effect on spinal cord injury through inhibiting the induction of iNOS expression.2 / 16 Key words Spinal cord injury; Melatonin; Inducible nitric oxide synthase (iNOS)脊髓損傷 (spinal cord inj

6、ury, SCI)后的繼發(fā)性損傷是一個復(fù)雜的病理過程, 包括興奮性氨基酸、氧化性代謝產(chǎn)物和致炎細胞因子等多種效應(yīng)因子的釋放，可導(dǎo)致脊髓組織不可逆損害，表現(xiàn)為不同程度的運動、感覺和自主神經(jīng)功能障礙。一氧化氮 (NO)作為在體內(nèi)廣泛存在并具有多重生物學(xué)效應(yīng)的信號介質(zhì)可能起很重要的作用，體內(nèi)NO由一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase, NOS)生成,NOS廣泛存在于包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的各系統(tǒng)中。NOS有3種亞型,其中誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)產(chǎn)生的 NO量大、持續(xù)時間長,通過直接引起過氧化損傷或作為信號介質(zhì)

7、介導(dǎo)其它炎癥因子而起作用，表現(xiàn)出強的神經(jīng)毒性。褪黑素(5-甲氧基-N-乙酰色胺,melatonin,MT)主要是由松果體分泌的激素,能直接清除自由基,減輕細胞的過氧化損害1。本試驗通過觀察大白鼠脊髓損傷后腹腔注射褪黑素對iNOS表達的影響，分析褪黑素在脊髓繼發(fā)性損傷中的可能作用，為臨床治療繼發(fā)性脊髓損傷提供理論及實驗依據(jù)，也為進一步實驗研究提供資料。1 材料與方法1.1 主要儀器與試劑 Olympus光學(xué)顯微鏡圖像采集系統(tǒng)顯微圖像分析系統(tǒng)(日本)，褪黑素購自晶美北京分公司(瑞士Alexis公司生產(chǎn))，兔抗大鼠iNOS多克隆抗體免疫組化試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒為武漢博士德生物工程

8、有限公司提供。1.2 實驗動物與分組 健康成年SD大鼠110只,雌雄各半,體重250330g。隨機分為假損傷組、損傷組和藥物治療組3組。其中損傷組和藥物治療組各50只，分5個時間點（損傷后8小時、24小時、72小時、7天、14天）處死；假損傷組10只，于手術(shù)后14天處死。藥物治療組術(shù)后立即給予褪黑素每天50mg/kg，腹腔注射，連用7天;而假手術(shù)組和損傷組給予等量含5%無水乙醇的生理鹽水。1.3 動物模型的建立 采用改良Allen's撞擊法，10%的水合氯醛按300mg/kg體重腹腔麻醉，俯臥位固定，常規(guī)碘伏消毒鋪巾，以T10棘突為中心行背側(cè)正中縱切約2.5cm,行T9、10椎板切除術(shù)

9、，暴露硬脊膜，在硬膜表面墊一彎曲度與脊髓表面一致的塑料墊片,用重10g金屬棒從4.0cm高處沿中空玻璃管垂直自由落下撞擊脊髓，造成急性脊髓損傷，假手術(shù)組只做T9、10椎板切除術(shù)，顯露硬脊膜，不用重物撞擊。造模成功的標志為大鼠的雙下肢呈回縮性撲動、尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動。造模成功的動物每天給予截癱護理，每日人工排尿排便3次。1.4 取材和HE染色 將各組大鼠在各相應(yīng)時間點麻醉下開胸,經(jīng)左心室-主動脈插管心臟灌注固定,先用等滲鹽水約250mL沖洗至流出澄清液,再用4%多聚甲醛約200mL灌流至動物完全僵硬,完整取出包括損傷段及其上下約1cm脊髓組織。迅速用4%甲醛液進行固定過夜，脫水，石蠟包埋，4m連

10、續(xù)切片，做HE染色,觀察病理改變。1.5 免疫組織化學(xué)染色及圖像分析 切片脫蠟水化后,用3%過氧化氫室溫孵育 10分鐘,滅活內(nèi)源性過氧化氫酶;5%BSA室溫封閉 20分鐘;加入180稀釋兔抗大鼠iNOS多克隆抗體 4過夜;滴加生物素化羊抗兔IgG 37 20分鐘;滴加SABC 37孵育 20分鐘;DAB顯色,蘇木素復(fù)染,封片。以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察陽性細胞胞漿呈棕黃色,每組抽取一張切片，每張切片任選5個高倍視野,應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)測定iNOS陽性細胞百分率和平均灰度值,取其平均值。1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計,各組數(shù)據(jù)采用x±s表示,陽性細胞百

11、分率和平均灰度值，采用兩獨立樣本均數(shù)的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 HE染色 假損傷組表現(xiàn)為正常脊髓組織的特點,顯示灰白質(zhì)交界清楚，神經(jīng)元豐富，胞體大，核仁明顯。損傷組傷后8小時見灰、白質(zhì)界限不清，有大量紅細胞滲出，神經(jīng)細胞變性；傷后24小時后大量出血、明顯水腫、神經(jīng)細胞變性、神經(jīng)元核濃聚；傷后72小時部分出血灶融合成小片狀，水腫明顯，神經(jīng)元變性，神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，部分出現(xiàn)壞死;傷后7天充血水腫減輕，灰、白質(zhì)有多個出血灶融合；神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞變性，部分崩解，神經(jīng)元數(shù)量減少；灰、白質(zhì)區(qū)均有空洞形成，大量小膠質(zhì)細胞浸潤，有炎細胞浸潤，毛細血管形成;傷后

12、14天充血水腫消退，灰、白質(zhì)區(qū)均有空洞，神經(jīng)膠質(zhì)增生明顯，較多結(jié)締組織增生。藥物治療組與損傷組相比，各時間點組織水腫較輕，出血較少，空洞形成較少，神經(jīng)元細胞較多，脊髓損傷均有不同程度的減輕。見圖1、圖2。 圖1 損傷組24小時（略）圖2 藥物治療組24小時（略）2.2 免疫組化檢測結(jié)果 假損傷組未見iNOS蛋白表達。脊髓損傷后,損傷組神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等中均可見不同程度的iNOS表達,以神經(jīng)元為主。損傷后8小時陽性細胞有表達,損傷后1天、3天表達增加明顯,7天達高峰,14天逐漸降低。與損傷組比較,褪黑素治療組各時間點脊髓組織iNOS蛋白表達降低，高峰亦發(fā)生在損傷后7天，陽性細胞百分率均顯著降

13、低，平均灰度值均顯著升高(P<0.05)。見表1。表1 大鼠脊髓iNOS免疫組化表達陽性指標測定（略）注：與同時間損傷組比較P<0.05,與同時間損傷組比較P<0.013 討論 SCI后的繼發(fā)性損傷是一個復(fù)雜的病理過程,包括興奮性氨基酸、氧化性代謝產(chǎn)物和致炎細胞因子等多種效應(yīng)因子的釋放，可導(dǎo)致脊髓組織不可逆損害。研究認為急性脊髓損傷后脊髓局部缺血、壞死,引起多種炎癥介質(zhì)釋放,并引發(fā)興奮毒性級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)iNOS高表達,產(chǎn)生過量的具有神經(jīng)毒性作用的NO,是造成急性脊髓損傷后繼發(fā)性神經(jīng)元死亡的直接因素2。NO作為在體內(nèi)廣泛存在并具有多重生物學(xué)效應(yīng)的信號介質(zhì)

14、在SCI的繼發(fā)性損傷中可能起很重要的作用，體內(nèi)NO由NOS催化生成,NOS廣泛存在于包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的各系統(tǒng)中。一氧化氮合酶有三種異構(gòu)體，分別為內(nèi)皮細胞型一氧化氮合酶(eNOS)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS)和誘生型一氧化氮合酶（iNOS）。eNOS和nNOS合稱固有型一氧化氮合酶（cNOS)，cNOS的活性為鈣依賴性，在正常生理條件下，催化合成基礎(chǔ)量的NO，抑制血小板聚集和粘附，從而維持血管舒張狀態(tài)，維持組織器官血流量在生理水平3;而iNOS的活性為非鈣依賴性，在正常生理狀態(tài)下含量極微4。組織細胞急性缺血早期，谷氨酸釋放增加，激活NMDA受體，受體介導(dǎo)性鈣內(nèi)流增多，激活cNOS使NO

15、生成增加。少量增加可以對抗創(chuàng)傷和缺血應(yīng)激引起的血管收縮。隨著損傷區(qū)中性粒細胞浸潤、炎性因子產(chǎn)生，轉(zhuǎn)錄因子NF-KB活化，使iNOS表達增加5,iNOS的活性為非鈣依賴性，一旦合成，持續(xù)催化生成大量的NO。體內(nèi)大量的NO導(dǎo)致自由基O-·2生成增多，或與自由基O-·2反應(yīng)生成作用更強的自由基ONOO-6。ONOO-氧化線粒體Mn-SOD使O-·2進一步積聚增加7。 褪黑素（MT）主要由松果體分泌,是存在于人體內(nèi)的重要神經(jīng)內(nèi)分泌活性物質(zhì),具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等重要功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)MT具有很強的清除羥自由基和過氧自由基作用8,不僅可直接清除OH-、O-·2等,還

16、可通過增加抗氧化酶的活性發(fā)揮抗氧化作用,是目前已知體內(nèi)最強的抗氧化成分。MT清除氧自由基的活性不需要其受體的調(diào)節(jié),MT抗氧化能力至少部分是通過直接清除自由基9。MT作為松果體分泌的激素,它具有高脂溶性和水溶性,能通過核膜進入核內(nèi)發(fā)揮作用,能使脫氧核糖核酸免受到氧的毒性作用10。因此MT不僅保護膜脂質(zhì),而且保護蛋白質(zhì)、核酸及細胞的其他成分。McCann等11發(fā)現(xiàn)NO可以激起松果體分泌MT增加，消除NO，減少NO神經(jīng)毒性，MT尚能顯著抑制iNOS基因相關(guān)表達。亦有研究表明,褪黑素還可直接清除一氧化氮12。NOS是產(chǎn)生自由基的酶之一,可促進一氧化氮的合成,一氧化氮與過氧化硝酸鹽結(jié)合產(chǎn)生自由基。褪黑素

17、能抑制iNOS的產(chǎn)生,從而減少毒性一氧化氮的生成。還有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可通過抑制谷氨酸引起的NO釋放增加,對抗其神經(jīng)毒性,保護神經(jīng)細胞免受損傷,為損傷后神經(jīng)細胞的恢復(fù)創(chuàng)造了有利條件13。 本實驗結(jié)果顯示，脊髓損傷后,損傷組神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等中均可見不同程度的iNOS表達,以神經(jīng)元為主。損傷后8小時陽性細胞有表達,損傷后1天增加明顯,7天達高峰,14天逐漸降低。與損傷組比較,褪黑素治療組各時間點脊髓組織iNOS蛋白的表達降低，高峰前移，發(fā)生在損傷后3天，陽性細胞百分率均顯著降低，平均灰度值均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；治療組大鼠脊髓組織病理改變較輕。提示褪黑素可能通過抑制脊髓組織中iNOS的表

18、達，減輕脊髓損傷后的繼發(fā)性損害，起到保護脊髓的作用。但對抑制iNOS的具體機制仍不清楚，需要進一步的研究。【參考文獻】 1 Russel JB, Dun XT, Carmen O, et al. Action of melatonin in the reduction of oxidation stressJ. Biomed Sci, 2000, 7: 444-458.2 Xu J, Kim GM, Chen SW，et al. iNOS and nitrotyrosine expression after spinal cord injuryJ. J Neurotrauma, 2001, 1

19、8: 523-531.3 Green LC, Tannbam SK, Tannenbam SR, et al. Nitrate Synthesis in the gemfree and conuentional ratJ.J Science, 1981, 225: 56-59.4 Nathan C, Xie QW. Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controlsJ. Cell, 1994, 78: 915-918.5 Bethea JR, Castro M, Keane RW, et al. Traumatic spinal cord in

20、jury induces nuclear factor-kappa B activationJ. J Neurosci, 1998, 18: 3251-3260.6 Wink DA, Mitchell JB. Chemical biology of nitric oxide:insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxideJ.J Free Radic Biol Med, 1998, 25: 434-56.7 Dawson TM, Gonzalez-Zulueta M, Kusel J. Nitric Oxide: diverse actions in the central and peripheral nervous systemsJ. J