肺癌Fas表達(dá)水平與抗Fas治療生物學(xué)效應(yīng)關(guān)系的研究

1、肺癌Fas 表達(dá)水平與抗Fas 治療生物學(xué)效應(yīng)關(guān)系的研究作者：李虹 鄭世營(yíng) 趙軍 蔣東 張曉膺【摘要】 目的：研究肺癌細(xì)胞表面Fas 表達(dá)水平與抗Fas治療生物學(xué)效應(yīng)之間的關(guān)系。方法：將低表達(dá)Fas 的肺癌細(xì)胞A-549細(xì)胞通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染Fas基因，并用流式細(xì)胞直接免疫熒光術(shù)檢測(cè)Fas的表達(dá)；采用鼠抗人Fas單克隆抗體 DX-IgG1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染Fas 基因的和未轉(zhuǎn)染Fas 的A-549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡作用,并用碘化丙啶染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。結(jié)果：轉(zhuǎn)染Fas基因后的A-549細(xì)胞Fas分子表達(dá)明顯增加,Fas分子表達(dá)率從26. 11%增加到68.69%;鼠抗人Fas單克隆抗體DX-IgG1誘

2、導(dǎo)的轉(zhuǎn)Fas基因的A-549細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,達(dá)66.3% ,而未轉(zhuǎn)基因的A-549細(xì)胞凋亡較少,僅7.4%。結(jié)論：人類惡性腫瘤細(xì)胞系對(duì)Fas抗體觸發(fā)凋亡信號(hào)的敏感性主要依賴于細(xì)胞表面Fas的表達(dá)水平。 【關(guān)鍵詞】 肺腫瘤；Fas；凋亡 Abstract Objective：To investigate the relationship between expression level of Fas and anti-Fas biological responsiveness. Methods：With direct immunofluorescence flow cytometry, ex

3、pression of Fas was detected in lung carcinoma cell line A-549 transfected and untransfected with Fas gene. Apoptosis was induced with anti-Fas antibody DX-IgG12 / 10 and measured by flow cytometry. Results：Expression of Fas was increased significantly, positive cell number increased from 26.11% to

4、68.69%; Apoptosis induced with anti-Fas antibody DX-IgG1(in lung carcinoma cell line A-549 transfected with Fas gene) reached 66.3%, significantly highier than that in lung carcinoma cell line A-549 untransfected(7.4%). Conclusion：The sensitivity of human malignant cell to Fas-mediated apoptosis is

5、mainly dependent on the expression of Fas. Key words Lung neoplasms；Fas；Apoptosis Fas是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡信號(hào)受體,當(dāng)與其特異性配體(FasL)結(jié)合后,可以傳導(dǎo)凋亡信號(hào),誘導(dǎo)Fas 所在細(xì)胞的凋亡1 。腫瘤細(xì)胞對(duì)Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)凋亡的敏感程度是由許多因素決定的,涉及到許多調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞表面表達(dá)有功能的Fas分子并達(dá)到一定水平是經(jīng)由Fas/FasL系統(tǒng)途徑進(jìn)行凋亡作用的重要因素2。我們通過對(duì)肺癌細(xì)胞株A-549轉(zhuǎn)染Fas基因后Fas表達(dá)水平增加,觀察Fas表達(dá)水平對(duì)Fas 抗體誘導(dǎo)凋亡作用的影響。 1 材

6、料和方法 1.1 細(xì)胞、培養(yǎng)條件及基因轉(zhuǎn)染方法 人肺癌細(xì)胞株A-549由中科院上海細(xì)胞所提供。RPMI-1640含有16% FCS，10 mmol/L Hepes 和2 mmol/L谷氨酰胺的培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 的CO2 孵箱內(nèi)。培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇后在4 周內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)研究。 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A-549肺癌細(xì)胞常規(guī)消化傳代培養(yǎng)，37 ，1824 h后，使細(xì)胞達(dá)到30%50%融合；無菌制備A 液：經(jīng)聚乙二醇法純化的真核表達(dá)Fas 質(zhì)粒pCMV-Fas(深圳晶美公司提供)2 g + 100 l 無血清RP-MI21640；B 液: 520 l Lipofectin 2000 + 100

7、l 無血清RPMI-1640；輕混A、B 液,室溫靜置1015 min；用無血清培養(yǎng)液洗細(xì)胞23 次；將A、B 混合液1.8 ml無血清培養(yǎng)液輕輕混加到細(xì)胞上；孵育612 h；用含F(xiàn)CS的全培養(yǎng)液換液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h；稀釋后傳代到選擇培養(yǎng)基中( G418濃度為800 g/ml)；每57 天換液1次并密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；1420天可見有細(xì)胞克隆長(zhǎng)出，繼續(xù)培養(yǎng)，待克隆長(zhǎng)到較大肉眼可見，直徑約12 mm時(shí)，將克隆灶移入96 孔板,長(zhǎng)滿后再移入24 孔板,最后在培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增培養(yǎng),傳代建系。 1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Fas 的表達(dá) 采用直接免疫熒光法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面Fas 的表達(dá)。FITC 標(biāo)記

8、的小鼠抗人Fas IgG1 DX-型抗體購(gòu)自美國(guó)Pharmingen 公司。同時(shí)做同型陰性對(duì)照反應(yīng),用同樣濃度的無關(guān)小鼠IgG1-FITC 代替DX-IgG1-FITC。采用Becton Dickinson 流式細(xì)胞儀和CELL Quest 配對(duì)軟件分析。死細(xì)胞及細(xì)胞碎片直接從細(xì)胞窗去除,每份標(biāo)本分析104 個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞表面熒光指數(shù)(SFI) 為特異Fas抗體染色的平均熒光強(qiáng)度值除以同型陰性對(duì)照抗體的平均熒光強(qiáng)度值。陽(yáng)性細(xì)胞百分率直接從門控直方圖中計(jì)算。A-549細(xì)胞經(jīng)確定轉(zhuǎn)染Fas后于2、5、8 h檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 1.3 Fas抗體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 采用鼠抗人Fas 單克隆抗體DX-IgG1

9、(深圳晶美公司提供)誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞凋亡。所用抗體濃度均為5 g/ml , 并加入蛋白A(終濃度為5 g/ml)和CHX(終濃度為10 g/ml)。每種細(xì)胞在加處理因素之前細(xì)胞數(shù)約為5×105，約達(dá)到70%80%融合。將抗體加入培養(yǎng)細(xì)胞共同作用24 h后，收集全部細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。 1.4 碘化丙啶(PI) 染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用80%的乙醇或細(xì)胞保存液固定細(xì)胞(包括離壁細(xì)胞)>12 h；8001000 r/min 離心5 min ,棄掉固定液后，PBS洗1次；8001000 r/min 離心5 min 后棄上清液，加入無DNA 酶的RNA 酶25 l(2 mg/ml

10、的RNA 酶，用PBS 配制，100 15 min，-20 保存) ;室溫30 min 后加入PBS 175 l 和PI工作液250 l (用蒸餾水溶解PI，配成1 mg/ml溶液,用時(shí)以PBS 10 倍稀釋)，4 20 min 后上機(jī)分析。通過分析亞二倍體核來判定凋亡細(xì)胞數(shù)量3。 1.5 Western blot檢測(cè)caspase-3表達(dá)及活性 蛋白的提取及Western blot分析：參照文獻(xiàn)4方法提取轉(zhuǎn)基因前、后的A-549l和A-549/Fas細(xì)胞的胞漿蛋白，核蛋白提取參照文獻(xiàn)3方法進(jìn)行，以Actin的水平作為等量蛋白質(zhì)上樣對(duì)照。比較A-549l和A-549/Fas細(xì)胞中凋亡效應(yīng)蛋白c

11、aspase-3的底物PARP的表達(dá)。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 100統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)及相關(guān)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.01示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié) 果 用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法成功地將Fas表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Fas 轉(zhuǎn)入肺癌細(xì)胞系A(chǔ)-549 ,篩選出陽(yáng)性克隆。將未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染Fas 基因的膀胱癌細(xì)胞系A(chǔ)-549細(xì)胞分別進(jìn)行直接免疫熒光法流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)細(xì)胞表面Fas的表達(dá)情況,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后的A-549J細(xì)胞Fas分子，F(xiàn)as分子表達(dá)率從26.11%增加到68.69%。收集經(jīng)鼠抗人Fas單克隆抗體DX-IgG1處理過的未轉(zhuǎn)基因的A-549細(xì)胞和轉(zhuǎn)Fa

12、s基因的A-549細(xì)胞的全部實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,包括離壁懸浮的細(xì)胞。按前述方法進(jìn)行PI染色、流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)Fas基因的A-549細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,達(dá)66.3%；而未轉(zhuǎn)基因的A-549 細(xì)胞凋亡較少,僅7.4%(圖1)。轉(zhuǎn)基因后A-549/Fas肺癌細(xì)胞和凋亡率之間的相關(guān)關(guān)系分析顯示，兩者呈顯著正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)r=0.647，P<0.01）（表1）。 Western blot顯示轉(zhuǎn)基因前、后caspase-3的底物PARP的改變：轉(zhuǎn)基因后，A-549/Fas細(xì)胞的核提取物中出現(xiàn)了85 kDa的PARP的分解片段，而A-549細(xì)胞中該片段含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P&a

13、mp;lt;005)(見圖2)。 3 討 論 Fas/FasL系統(tǒng)在惡性腫瘤中的生物學(xué)作用還沒有完全了解,但它在凋亡中的作用表明了它可以作為腫瘤生長(zhǎng)的抑制因子。根據(jù)Fas信號(hào)可以誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞凋亡的特點(diǎn),利用特異性抗體或配體作為拮抗劑,可以產(chǎn)生有效的抗腫瘤治療作用4-6。 細(xì)胞膜表達(dá)有功能的Fas蛋白,并且其表達(dá)量達(dá)到一定強(qiáng)度是通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)凋亡作用的首要條件6。對(duì)于不表達(dá)或弱表達(dá)Fas分子的細(xì)胞,其基因在分子調(diào)節(jié)中也存在轉(zhuǎn)錄活化或去抑制的潛能。通過某些細(xì)胞因子可以上調(diào)Fas的表達(dá)水平7,8,進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)染來提高Fas表達(dá)水平也是有效的方法。我們用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法成功地

14、將Fas表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Fas轉(zhuǎn)入到了肺癌細(xì)胞系A(chǔ)-549，篩選出陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行了鑒定。直接免疫法流式細(xì)胞術(shù)證明轉(zhuǎn)染后的A-549細(xì)胞系Fas分子表達(dá)明顯增加。 人類惡性腫瘤細(xì)胞系對(duì)Fas抗體或配體觸發(fā)凋亡信號(hào)的敏感性主要依賴于細(xì)胞表面Fas的表達(dá)水平5。我們將低表達(dá)Fas的肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)Fas基因后顯著地增加了表達(dá),再用Fas抗體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致了A-549細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多；而未轉(zhuǎn)Fas基因的A-549細(xì)胞由于Fas表達(dá)較低,細(xì)胞凋亡數(shù)也較少,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了Fas分子的表達(dá)水平在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的重要作用,同時(shí)也證明了Fas系統(tǒng)依賴性凋亡的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑是可以以某種方式活化的,與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論一致1，10。因而,深入研究細(xì)胞表面Fas表達(dá)的調(diào)控因素十分必要。 Fas缺陷的小鼠不表達(dá)或表達(dá)突變的Fas分子而不能起到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)作用。相當(dāng)多的腫瘤細(xì)胞存在著Fas分子的結(jié)構(gòu)性低表達(dá)或喪失表達(dá)9，可能促使腫瘤細(xì)胞逃逸