核桃葉片總RNA提取方法的比較研究

1、核桃葉片總RNA提取方法的比擬研究 核桃葉片總RNA提取方法的比擬研究 摘要：通過比照Trizol、EASYspin和Qiagen 3種試劑盒提取方法，探討適合核桃葉片總RNA提取的有效方法。結(jié)果說明EASYspin試劑盒提取的RNA純度較高、完整性好，試驗用時較短，且試劑盒本錢較低。 關(guān)鍵詞：核桃；總RNA；Trizol；EASYspin；Qiagen 中圖分類號：Q522文獻標識號：A文章編號：1001-494202-0011-03 核桃是我國重要的干果樹種，栽培歷史悠久，分布廣泛。目前，我國核桃的栽培面積和產(chǎn)量均居世界第一位【1】。RNA提取是分子生物學(xué)研究的根底，也是試驗成敗的關(guān)鍵。關(guān)

2、于植物RNA提取的方法很多，但由于不同植物材料細胞中次生代謝產(chǎn)物的種類、含量不同，適合的提取方法也不相同。核桃組織中富含多糖多酚等物質(zhì)。酚類化合物在勻漿時極易被氧化成醌類物質(zhì)， 與RNA 產(chǎn)生不可逆的結(jié)合， 從而影響RNA 的別離純化【2】。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA 相似，在提取過程中易與RNA 形成共沉淀【3】，且后期很難將其別離開，對RNA的別離和純化造成很大的干擾。假設(shè)RNA提取方法不當，會導(dǎo)致RNA埋在多糖形成的粘稠膠狀物中難于溶解、別離，嚴重影響后續(xù)試驗的穩(wěn)定性。隨著核桃研究的不斷深入，對核桃總RNA質(zhì)量的要求也越來越高，因此，有必要篩選理想的提取方法。 本研究用Trizol、EA

3、SYspin和Qiagen 3種試劑盒提取核桃葉片總RNA，通過對RNA純度和完整性的比擬，篩選最適合核桃葉片總RNA提取的方法，為今后核桃的分子生物學(xué)試驗奠定根底。 1材料與方法 1.1試驗材料 本試驗所用材料采自國家果樹種質(zhì)泰安核桃板栗資源圃，隨機從樹的不同方位挑取生長發(fā)育正常的幼葉，立即液氮速凍，于-70超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?1.2試劑與耗材 Trizol、EASYspin RN09與Qiagen 3種試劑盒分別購自北京全式金生物技術(shù)、北京艾德萊生物科技和德國凱杰公司。試驗所用器皿用0.1% DEPC水處理24 h以上，然后高溫滅菌；研缽、玻璃器皿等在180高溫烘烤12 h以上，備用。

4、 1.3試驗方法 提取方法均按相應(yīng)試劑盒說明書進行。RNA溶解后，分別取2 l樣品，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)下觀察RNA條帶的完整性，并拍照記錄；另分別取1 l樣品，用紫外分光光度計測定230、260、280 nm下的OD值，并計算OD260/OD280、OD260/OD230值及RNA產(chǎn)率。 2結(jié)果與分析 2.13種方法提取總RNA的完整性比擬 Trizol試劑盒法提取核桃葉片未能得到肉眼可見的白色RNA沉淀，EASYspin試劑盒與Qiagen試劑盒均為離心柱型試劑盒，提取過程中無法判斷沉淀量。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，Trizol試劑盒法沒有獲得RNA，只有少量降

5、解物；EASYspin試劑盒法和Qiagen試劑盒法提取的核桃葉片總RNA均可見28S、18S和5S RNA譜帶，其條帶清晰、明亮、完整、無拖尾現(xiàn)象，說明提取的RNA濃度較高、獲得量較大且完整無降解。EASYspin試劑盒法點樣孔處比擬干凈，說明提取過程中DNA和蛋白質(zhì)等污染很少；Qiagen試劑盒法點樣孔處有少量殘留，說明有微量DNA或蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的污染。綜合比擬可知，EASYspin試劑盒法提取的RNA質(zhì)量較高，效果較好。 3結(jié)論與討論 核桃葉片中富含多糖多酚等物質(zhì)，酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆的結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性喪失或形成不溶性復(fù)合物；多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀46。

6、因此，必須選擇去除多糖多酚的方法進行核桃RNA的提取。EASYspin試劑盒中的RNA助提劑PLANTaid能夠幫助結(jié)合多糖多酚，并通過離心去除，提高去除效果。本試驗結(jié)果顯示，Trizol試劑盒法未能提取到RNA，EASYspin與Qiagen試劑盒法提取過程根本相似，方便快捷，提取RNA的質(zhì)量與產(chǎn)率相當，且用時較短，整個過程不到1 h，與CTAB等方法710相比大大縮短了試驗時間。此外，與進口的Qiagen試劑盒相比，國產(chǎn)的EASYspin試劑盒價格低廉很多。 因此，EASYspin試劑盒法最適合核桃葉片總RNA的提取，該法獲得的RNA完整性好，無降解，純度和產(chǎn)率較高，試驗耗時少，且試劑盒本

7、錢較低。本試驗結(jié)果為核桃cDNA文庫的構(gòu)建、RT-PCR及其他分子生物學(xué)研究奠定了良好的根底，也為其他植物材料的RNA提取提供參考。 參考文獻： 【1】郗榮庭， 張毅萍. 中國果樹志核桃卷M.北京：中國林業(yè)出版社， 1996. 【2】Loomis W D. Overcoming problems of phenolics and quinines in the isolation of plant enzymes and organellesJ. Meth. Enzymol.， 1974， 31： 528-544. 【3】Logemann J， Schell J， Willmitzer L.

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