第六章--熒光分光光度法

1、l基本要求： 了解熒光光譜法的基本原理和應(yīng)用特點(diǎn)。了解熒光分光光度計的組成以及特點(diǎn)。掌握熒光光譜法的定量分析方法。了解影響熒光強(qiáng)度的因素。第一節(jié)第一節(jié) 概論概論 回顧： 四大類電化學(xué)分析法光學(xué)分析法色譜分析法其它分析方法 原子光譜法 分子光譜法 X射線光譜法 核磁波譜法 紫外-可見光分光光度法 熒光分光光度法紅外吸收光譜法 拉曼光譜法 1.定量分析 能產(chǎn)生熒光 或能形成熒光配合物的物質(zhì)。2.簡單定性 回答“是不是”。二、特點(diǎn)：二、特點(diǎn)： 靈敏度高，比吸收光譜法高10104倍。ppb選擇性比吸收光譜法好。一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生 物質(zhì)吸收光輻射 價電子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)，然后再回到基態(tài)

2、 釋放能量以熱能的形式。以光輻射的形式。以光輻射形式釋放能量時，發(fā)射熒光。這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。熒光磷光無輻射躍遷激發(fā)態(tài)亞穩(wěn)態(tài)（三重態(tài)）基態(tài) 最常見的光致發(fā)光：熒光和磷光。 兩者發(fā)光機(jī)理不同，壽命不同。熒光壽命10-910-6秒，磷光壽命10-310秒。 熒光可由激發(fā)態(tài)的分子產(chǎn)生，也可由激發(fā)態(tài)的原子產(chǎn)生，本章介紹分子熒光。 由于熒光的產(chǎn)生由價電子引起，所以，熒光光譜屬于電子光譜，其波長范圍位于：紫外光區(qū)和可見光區(qū)。 激發(fā)光譜激發(fā)光譜 固定熒光波長，以激發(fā)光波長對熒光強(qiáng)度(F)所作的光譜曲線。300350400(nm) F【例】硫酸奎寧（0.1mol/L硫酸溶液）的激發(fā)光譜。 發(fā)射光譜發(fā)射光譜

3、固定激發(fā)光波長，以熒光波長對熒光強(qiáng)度F所作的光譜曲線。300350400(nm) F【例】蒽（乙醇溶液）的發(fā)射光譜。 分子要產(chǎn)生熒光，首先要能吸收紫外光或可見光。能產(chǎn)生熒光的分子具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：共軛雙鍵剛性平面多環(huán)結(jié)構(gòu) 【例】芴具有剛性平面，產(chǎn)生的熒光比聯(lián)二苯強(qiáng)。CH2：量子效率，發(fā)射光量子與吸收光量子之比。 I0：入射光強(qiáng)度：摩爾吸光系數(shù) b： 光程 c：濃度F=2.303I0bc公式成立前提條件：bc=A0.05 即：當(dāng)試樣濃度較低時（c0.05/b），C與F方成線性。（如果濃度過高，分子碰撞機(jī)會增大，而產(chǎn)生無輻射去激活，造成線性偏離。）一、基本結(jié)構(gòu)示意圖一、基本結(jié)構(gòu)示意圖 特點(diǎn)：1 光源

4、方向與檢測方向成直角； 2 二個單色器。顯示器檢測器熒光單色器樣品池激發(fā)光單色器光源1光源光源高壓汞蒸氣燈，氙燈。能提供紫外光和可見光，光強(qiáng)度比紫外-可見光分光光度計光源大得多。2激發(fā)光單色器激發(fā)光單色器作用：提供單波長的激發(fā)光。色散元件：棱鏡或光柵。出射狹縫寬度可調(diào) 。3樣品池樣品池須用石英材料制成。4熒光單色器熒光單色器將樣品池中的散射光、反射光、雜質(zhì)熒光等濾掉，只讓熒光通過。出射狹縫寬度可調(diào)。5檢測器檢測器光電轉(zhuǎn)換元件，測定熒光的強(qiáng)度。檢測方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒有透過光的干擾。由于熒光的強(qiáng)度較弱，一般以光電倍增管作檢測器。一、定量方法一、定量方法 一般采用工作直線法。作CF

5、直線。FC配制一系列待測成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液 C1 C2 C3 C4 C5測出相應(yīng)的熒光強(qiáng)度 F1 F2 F3 F4 F5建立工作直線（ F C） 作圖法 回歸法測量待測樣品，得F樣 從工作直線上找到待測成分的濃度C樣 由回歸方程計算出C樣1激發(fā)光照射激發(fā)光照射有一些熒光物質(zhì)若受到強(qiáng)光照射，會發(fā)生分解而導(dǎo)致F。所以，熒光分光光度計通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在測定時才打開光閘讓激發(fā)光照射樣品池。2溫度溫度溫度，熒光效率下降，F(xiàn)。（因?yàn)椋瑴囟?，增加分子間碰撞機(jī)會而使能量消耗掉。）4溶劑溶劑 有些溶劑會使熒光效率下降，也可能帶來干擾熒光。 苯胺pH712時，發(fā)蘭色熒光。pH2或PH13時，無熒光?！纠克?，有時需要pH緩沖液控制pH值在適當(dāng)范圍內(nèi)。3pH值值 pH值能改變某些熒光物質(zhì)的電子構(gòu)型從而影響熒光強(qiáng)度。l靈敏度高。可高達(dá)ppb級（10-9），甚至ppt級（10-12）。l選擇性好，與能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)少有關(guān)。一、概念l（熒光）激發(fā)光譜l（熒光）發(fā)射光譜二、問答題l試述分子熒光產(chǎn)生的過程。l試述分子熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系式，并說明公式成立的前提條件及原因。l分別說明熒光分光光度計兩個單色器的作用，以及將光路設(shè)計成直角方向的原因。l為什么可見光分光光度計的光路是直線方向，而熒光分光光度計的光路是直角方向