中國沼蝦屬分子系統(tǒng)學(xué)及日本沼蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究

1、yiT論女第表站家中國沼蝦屬分子系統(tǒng)學(xué)及日本沼蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究【摘要】：沼蝦屬 Macrobrachium 是一類生存環(huán)境多樣，起源與分化過 程尚不甚明了，分類地位具爭議性的動物類群。眾多學(xué)者在分類方面 已做了大量的研究，然而由于其鑒別特征的保守性及形態(tài)性狀多態(tài)性 豐富等特點(diǎn)，導(dǎo)致了沼蝦屬種類鑒定的困難，使得相關(guān)研究難以深入。本研究以中國境內(nèi)分布的沼蝦屬種類為主要研究對象，利用 DNA 測序、PCR-RFLP 技術(shù)和 ISSR 技術(shù)等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，運(yùn)用支序系 統(tǒng)學(xué)與分子進(jìn)化生物學(xué)理論及分析方法，以地理群體為基本研究單元, 展開從地理種群-物種-屬的逐級水平的系統(tǒng)學(xué)研究。探討長臂蝦亞科

2、 各屬、沼蝦屬各種及日本沼蝦不同地理群體的分子遺傳學(xué)特征，并重建系統(tǒng)發(fā)育樹。 其次，在重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹的基礎(chǔ)上，詮釋現(xiàn)存的種、屬分類問題。此外，本研究對揭示沼蝦屬種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、澄清 其種屬分類問題、 對整個沼蝦屬的系統(tǒng)演化與分類格局關(guān)系的研究具 有重要意義。還可揭示主要經(jīng)濟(jì)種類日本沼蝦地理群體之間的遺傳多 樣性信息，為有效保護(hù)和合理開發(fā)利用野生資源提供重要的理論基 礎(chǔ)。本研究主要從以下幾個方面進(jìn)行研究:1.應(yīng)用支序系統(tǒng)學(xué)的原理和 方法，選取長臂蝦亞科 9 屬60 物種和 Procaridae 科 2 物種（外群）的形 態(tài)和生態(tài)性狀。并對其分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、形態(tài)學(xué)及部分生物學(xué)等方面 的文獻(xiàn)

3、資料進(jìn)行綜合分析，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和系統(tǒng)發(fā)育研究。構(gòu)建的 嚴(yán)格一致樹顯示,（1）兩個外群聚為一支，與內(nèi)類群的物種分開，位于支 序圖的基部。內(nèi)類群長臂蝦亞科的60 個物種由 3 個主要特征（即尾節(jié)yiT論女第表站家常具 2 對末端刺，有 2 或更多對中央剛毛，第三顎足常具 2 關(guān)節(jié)鰓）構(gòu)成一支，形成一個單系群。（2）沼蝦屬也形成一個單系群，由頭胸甲具肝刺，無鰓甲刺支持與其它幾個屬區(qū)分開來。（3）其他幾個屬間的親緣關(guān)系并不明確。說明 Holthuis（1950）和 Chace（1992 所建立的分類系統(tǒng)雖然能夠?qū)⒁恍┓N類區(qū)分開來，但是無法反映出這些類群的親緣關(guān)系。2.利用線粒體16SrDNA部分序列

4、對我國沼蝦屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了 探討，使用 PAUP 軟件構(gòu)建 NJ、MP、ML 系統(tǒng)樹，使用 MrBayes3.0b4 軟件構(gòu)建 BI 樹。在忽略小于 50%的支持率后，這四種系統(tǒng)樹所顯示的 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有一定一致性，所有結(jié)果均支持沼蝦屬為單系群，但在幾種 沼蝦的相互關(guān)系上有所區(qū)別。為了得到四種分析方法一致的沼蝦屬系 統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們構(gòu)建了這四棵樹的 50%合一樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沼蝦屬可分 為第二對步足左右不對稱的類群和第二對步足左右對稱的類群。另外,外形上極易混淆的三種沼蝦（日本沼蝦、胖掌沼蝦和細(xì)螯沼蝦）的分子 數(shù)據(jù)顯示其親緣關(guān)系很近。 3使用分子鑒別方法對我國代表地區(qū)的日 本沼蝦、細(xì)螯沼蝦和胖

5、掌沼蝦進(jìn)行分類研究。共使用了 3 種分子標(biāo)記，即線粒體16SrDNA、CO 和 D-loopPCR-RFLP。線粒體 16SrDNA 和 COI 基因序列分析結(jié)果顯示這三種沼蝦之間的差異小于沼蝦屬不同 種間的遺傳差異，并與沼蝦屬同種不同群體間的遺傳差異有重疊現(xiàn) 象。 D-loopPCR-RFLP的結(jié)果亦顯示這三種沼蝦間的遺傳距離比羅氏 沼蝦與這三種沼蝦間的距離小得多。 三種分子數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 也顯示不同采集地點(diǎn)的日本沼蝦、細(xì)螯沼蝦和胖掌沼蝦之間的親緣關(guān) 系很近。因此結(jié)合三種分子標(biāo)記的結(jié)果推測這三種沼蝦間的差異處于種內(nèi)水平，它們可能是同一物種。4日本沼蝦 Macrobrachiumnipp

6、onense是我國分布范圍廣、經(jīng)濟(jì)價值較大的一種重要淡水蝦類。 使用線粒體 COI基因片段與 ISSR 標(biāo)記技術(shù)，對我國日本沼蝦長江水系和瀾滄江水 系的 10個野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，顯示大致可分為長江上游及 瀾滄江族群、長江中游族群和長江下游族群。群體間存在遺傳差異，且各群體間的遺傳差異與其地理分布關(guān)系密切。兩種分子標(biāo)記的研究結(jié)果均顯示湖北武漢群體的遺傳多樣性高，意味著該群體對外界環(huán)境 變化的適應(yīng)能力較強(qiáng)。遺傳距離和聚類圖顯示浙江湖州(HZ)、江蘇蘇 州(SZ)與上海(SH)群體的親緣關(guān)系較近。從整個日本沼蝦物種來說，存在較高的遺傳多樣性。線粒體 CO I序列的研究結(jié)果相對于其他間 接分

7、子標(biāo)記，能夠直接揭示物種的遺傳變異，但是相對耗時，花費(fèi)較高。 因此在無相關(guān) DNA 序列信息的情況下，ISSR 標(biāo)記技術(shù)是一個非常有 效的檢測群體遺傳變異的遺傳標(biāo)記?！娟P(guān)鍵詞】：長臂蝦亞科沼蝦屬日 本沼蝦支序系統(tǒng)學(xué)系統(tǒng)發(fā)育遺傳結(jié)構(gòu) 16SrDNACOID-looPPCR-RFLPISSR【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)【學(xué)位級別】：博士【學(xué)位授予年份】：2007【分類號】：Q953yiT論女為表&?！灸夸洝浚褐形恼?9-11 英文摘要 11-14 第一章緒論 14-34 引言 14 二沼蝦屬的研究概況 14-231 基于形態(tài)特征的系統(tǒng)分類學(xué)研究14-162細(xì)胞遺傳學(xué)研究 16-183

8、分子系統(tǒng)學(xué)研究 18-194 群體遺傳學(xué)研究 19-23 三常用的分子標(biāo)記技術(shù)23-271 分子標(biāo)記技術(shù)（間接方法）23-262DNA序列測定（直接方法）26-27 四分子系統(tǒng)學(xué)及種群遺傳學(xué)研究方法 27-321外群的選擇 272 常用的建樹方法 27-293 評估數(shù)據(jù)系統(tǒng)發(fā)育信 號和進(jìn)化樹的可靠性與置信度的檢驗(yàn) 29-32 五沼蝦屬研究中存在的問 題及本研究的目的與意義 32-34 第二章我國長臂蝦亞科系統(tǒng)發(fā)育研究34-45 一前言 34-35 二材料與方法 35-411 材料 35-362 研究方法 36-41 三結(jié)果 41四討論 41-45第三章應(yīng)用線粒體 16SrDNA序列初步探討我

9、國沼蝦屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系45-70一前言45二材料與方法45-511研究 材料45-472實(shí)驗(yàn)方法 47-483 數(shù)據(jù)分析 48-494 外群選取 495 系統(tǒng)發(fā)育 關(guān)系的構(gòu)建49-51 三結(jié)果 51-591 沼蝦屬的系統(tǒng)發(fā)生分析 51-521.116SrDNA 序列組成分析 511.2 序列信息檢驗(yàn) 51-522 系統(tǒng)發(fā)育 關(guān)系 52-572.1NJ 樹52-542.2MP 樹 54-552.3ML 樹 55-562.4BI 樹 56-573 四種建樹方法得到的系統(tǒng)樹的比較和總結(jié)57-59 四討論 59-701 所研究類群 16SrRNA 基因部分片段的序列組成和分子進(jìn)化 59-602 沼蝦屬

10、 的單系性 60-613 沼蝦屬的類群劃分 614 四種方法重建系統(tǒng)發(fā)育樹的 比較61-70 第四章我國沼蝦屬部分種類的分子鑒別70-90 一前言 70-71二材料與方法 71-731 樣品采集和 DNA 提取 712PCR 擴(kuò)增和序列測定71-723 數(shù)據(jù)分析 72-73 三結(jié)果 73-81116SrDNA 序列分析結(jié)果73-772mtDNACO I 基因序列分析結(jié)果 77-803PCR-RFLP 分析結(jié)果C 易發(fā)表用yiT論女第表匸冢80-81 四討論 81-901 日本沼蝦、 細(xì)螯沼蝦和胖掌沼蝦間的親緣關(guān)系 82-832分子標(biāo)記的選取 83-90 第五章日本沼蝦不同地理群體的遺傳結(jié) 構(gòu)

11、90-117第一節(jié)利用 CO I 基因部分序列分析日本沼蝦 Macrobrachiumnipponense群體的遺傳結(jié)構(gòu)92-106 一材料與方法92-941 樣品的采集和 DNA 提取 922PCR 擴(kuò)增和序列測定 92-933 數(shù)據(jù) 分析 93-94 二結(jié)果 94-1001 日本沼蝦線粒體 CO I基因序列特征 942 單倍型之間的關(guān)系 943 分子群體遺傳結(jié)構(gòu) 94-98446 個單倍型構(gòu)建的 分子系統(tǒng)樹98-100 三討論 100-1061mtDNACO I 作為群體遺傳多樣性 的分子標(biāo)記1002COI 基因片段組成分析 100-1013 日本沼蝦不同地理 群體的遺傳結(jié)構(gòu)101-1024 日本沼蝦群體間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系102-106第二節(jié)日本沼蝦地理群體 ISSR 分子標(biāo)記的初步研究 106-117 一材料 與方法 106-1081 樣品的采集和 DNA 提取 1062PCR 反應(yīng)體系 106-1073 數(shù)據(jù)處理 107-108 二結(jié)果 108-1131 引物篩選結(jié)果 108-1092ISSR 擴(kuò)增 結(jié)果109-1103 日本沼蝦不同地理群體的遺傳結(jié)構(gòu)110-1124 聚類分