表面與界面課題組實驗方法整理

1、第一章 細(xì)胞實驗相關(guān)1.1細(xì)胞培養(yǎng)、增殖或毒性檢測1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：1. 將凍存細(xì)胞從液氮中取出，37 °C 水浴解凍。2. 將解凍細(xì)胞懸浮液從凍存管中轉(zhuǎn)移到離心管中，1000 r/min離心5 min.3. 離心之后去除上層清液，加入新鮮培養(yǎng)基，充分吹打之后再次離心處理一次4. 離心之后去除上層清液，加入新鮮培養(yǎng)基，充分吹打5. 將吹打均勻的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并加入適量新鮮培養(yǎng)基，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6. 細(xì)胞培養(yǎng)3、4天左右培養(yǎng)皿中細(xì)胞覆蓋率80 %左右分盤繼續(xù)培養(yǎng)，最后根據(jù)實驗樣品數(shù)目計算所用細(xì)胞數(shù)合理進(jìn)行分盤滿足實驗所用1.1.2 細(xì)胞增殖：1. 樣品消毒處理

2、：根據(jù)樣品不同，可以選擇高壓蒸汽滅菌、酒精消毒、紫外照射消毒。2. 培養(yǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，移去培養(yǎng)基， PBS沖洗兩遍，加入適量胰酶（預(yù)先預(yù)熱，小盤0.5 ml，大盤1 ml），放在培養(yǎng)箱中23 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞解粘附即可（細(xì)胞形貌成球形），加入新鮮培養(yǎng)基，充分吹打培養(yǎng)皿底部，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到新離心管中，離心1000 r/min離心5 min。3. 離心后，將離心管中上清液去掉，加入適量新鮮培養(yǎng)基，充分吹打，形成細(xì)胞分布均勻的懸浮液，取10 µl，用細(xì)胞計數(shù)器在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，得到細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞濃度4. 根據(jù)樣品數(shù)量計算所用細(xì)胞總數(shù)（單個樣品細(xì)胞接種密

3、度為5 × 104）以及所用含細(xì)胞的懸浮液體積（單個樣品所用含細(xì)胞的懸浮液200 µl），根據(jù)前一步所得細(xì)胞濃度，取一定體積懸浮液，加入新培養(yǎng)基，配制滿足實驗需要的含細(xì)胞的新懸浮液，充分吹打，制得用于接種的細(xì)胞懸浮液。5. 消毒后的樣品轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板中，PBS清洗兩遍（每次10 min），每個樣品預(yù)先加入800 µl培養(yǎng)基，然后加入200 µl含有細(xì)胞的懸浮液，輕輕搖晃混合均勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、4、7天。6. 細(xì)胞培養(yǎng)到預(yù)定時間，進(jìn)行定量分析的樣品，取出原培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，將樣品轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)板中，加入0.5 ml含有10 % Alarm

4、aBlue的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h之后，搖晃均勻后，取出100 µl培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到96孔板中，在波長570 nm和600 nm下測量吸收值，根據(jù)公式計算得到細(xì)胞的增殖率。7. 細(xì)胞培養(yǎng)到預(yù)定時間，進(jìn)行表面形貌觀察的樣品，取出原培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，將樣品轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)板中，加入2.5 %戊二醛溶液，4 °C避光過夜保存進(jìn)行細(xì)胞固定。之后樣品依次用30 %，50 %，75 %，90 %，95 %，100 %的乙醇/水溶液進(jìn)行脫水，之后用六亞甲基硅烷/乙醇溶液（1:2，2;1和純六亞甲基硅烷）進(jìn)行干燥，在通風(fēng)櫥中充分干燥后，表面噴金用掃描電鏡觀察細(xì)胞形貌。1.1.3

5、 細(xì)胞毒性：用樣品直接測試毒性和細(xì)胞增殖實驗步驟一樣，如果用浸提液做步驟稍作改變即可，如下：1. 樣品浸提液制備，將消毒樣品在培養(yǎng)基中浸泡24 h，所得浸提液為100 %浸提液，可以根據(jù)需要和設(shè)計稀釋為不同濃度的浸提液2. 將細(xì)胞提前接種于96孔板中，培養(yǎng)一天，之后將原培養(yǎng)基移除，加入浸提液共同培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)預(yù)定時間（比如1 d或3 d）3. 與測定細(xì)胞增殖方法一樣，測量與細(xì)胞浸提液共同培養(yǎng)后細(xì)胞增殖速率，與陰性對照和陽性對照組比較，計算得到細(xì)胞活性，從而判斷浸提液對細(xì)胞生長是否顯示毒性1.2干細(xì)胞骨架染色1.2.1 經(jīng)驗分享因PEEK分子中苯環(huán)結(jié)構(gòu)會在汞燈光源下被激發(fā)出熒光，致使背底熒光較深

6、，無法識別細(xì)胞，因此有關(guān)熒光染色的實驗均不適用于PEEK材料。1.2.2所需用具及藥品PBS（細(xì)胞房內(nèi)/外用），4%PFA，0.1V%Triton X-100，1wt%BSA，F(xiàn)ITC，DAPI，指甲油或502，蓋玻片（提前準(zhǔn)備好用24孔板切割成的獨立小孔罩，并超聲清洗干凈，以保護(hù)樣品用于觀察）。1.2.3 實驗步驟注意：整個固定、染色及觀察過程需在避光環(huán)境中進(jìn)行，以防熒光過早淬滅1. 接種細(xì)胞，1 x1樣品（每組34個，每個時間點各1個），密度5x104 cell/ml；2. 到時間后（一般為1/4/24h或1/3/6/24h，根據(jù)具體情況定），將樣品換至新的24孔板，以去除24孔板中樣品外

7、細(xì)胞的影響，用PBS清洗2遍，每遍5min；3. 用4%PFA固定10min，用量為每孔500L；4. PBS清洗3遍，每遍5min；5. 用0.1V%Triton X-100通透，每孔500L，時間2min; (PBS稀釋：50mL PBS中加50L Triton)6. PBS清洗3遍，每遍5min；7. 加入500L 1wt%BSA（用PBS稀釋），時間20min；8. PBS清洗1遍，5min；9. 加入100L（PBS和FITC混合液），染骨架，60min（1h）；(配制比例為1.2ml PBS：20LFITC)10. PBS清洗3遍，每遍5min；11. DAPI染核5min，每孔加

8、入500L；(配置比例為DAPI：PBS=1:1000)12. PBS清洗3遍，每遍5min；13. 準(zhǔn)備好蓋玻片，上滴約5L抗熒光淬滅劑，將樣品正面朝下反扣至抗熒光淬滅劑上（注意盡量避免氣泡），然后用經(jīng)超聲清洗的24孔板小孔罩罩住樣品并進(jìn)行標(biāo)記，四周涂上指甲油或502固定樣品；14. 置于熒光顯微鏡暗場模式下進(jìn)行觀察并拍照。1.3干細(xì)胞礦化1.3.1 經(jīng)驗分享對染料吸附嚴(yán)重的材料體系（如納米多孔材料）以及表面膠體分散性較差的材料體系（如Zeta電位絕對值小于20）因?qū)θ玖衔捷^牢使得多余的染料難以經(jīng)蒸餾水洗去，而在后續(xù)定量過程中又能經(jīng)10%CPC洗脫從而使定量結(jié)果嚴(yán)重偏大，因此不適用此法。1

9、.3.2所需藥品PBS（細(xì)胞房內(nèi)用），75%酒精；蒸餾水（或超純水），10v%氨水（ammonium hydroxide）：40mM茜素紅(alizarin red)：稱取2g茜素紅溶于100ml蒸餾水，混合均勻后用10%氨水調(diào)節(jié)pH至4.14.3，The pH is critical, so make fresh or check pH if the solution is more than one month old。10%氯化十六烷吡啶(Cetylpyridinium chloride, Cat NO.：30037326(國藥)：10g CPC+100ml水。10 mM磷酸鈉(Na3P

10、O4，sodium phosphate)：稱取磷酸鈉1.64g，用水溶解定容到1000ml。1.3.3 實驗步驟1. 接種細(xì)胞，1 x1樣品（每組8個，7/14d各4個），密度一般取1 x104 cell/ml for 7d and 0.5x104 cell/ml for 14d or 1 x104 cell/ml for both 7 and 14d；2. 到時間后（7d/14d），將樣品換至新的24孔板，用 PBS 漂洗三次然后用 75%的酒精固定 1 h；3. 固定完后再用 PBS 漂洗三次；4. 用溶解在飽和苦味酸中的 0.1%天狼星紅對細(xì)胞分泌的膠原進(jìn)行染色，染色過程持續(xù) 18 20

11、h；5. 到時間點后用 0.1 M 的乙酸反復(fù)漂洗試樣直至無顏色析出為止，體式顯微鏡照相（熒光顯微鏡明場模式）；6. 為了進(jìn)行定量比較，每孔加入 500 ml 的洗脫液（用 0.2 M 氫氧化鈉和甲醇以 1：1 的比例配制），振蕩 15 min 將試樣表面的染料洗脫下來，在 540 nm 測其吸光度。1.4 qPCR實驗方法1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)和提取3個2x2的大片，放于一個小培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為7天1x105，14天減半，并加入4mL 培養(yǎng)基，每隔3天換液，培養(yǎng)相應(yīng)時間點(7，14天)后，將樣品換到新的培養(yǎng)皿中（鑷子須酒精烘烤滅菌），用PBS清洗2遍，并加入1mL TRIzol試劑，用槍頭反

12、復(fù)吹打樣品表面以使細(xì)胞全部裂解，將TRIzol試劑收集后放入1.5mL離心管中待用，-80保存或進(jìn)行下一步實驗。1.4.2 RNA提取將提取的細(xì)胞放于常溫解凍，孵化后加入0.2mL氯仿并劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min后進(jìn)行離心（離心參數(shù)12000xg，15min，4）；離心后可見液體分成，去上層清液約0.5mL（attention：勿取到下面紅色液體），之后加入0.5mL異丙醇并上下輕微晃動，室溫放置10min后進(jìn)行離心（離心參數(shù)12000xg，10min，4），此時可見RNA沉積于離心管底部；之后取出所有液體，只殘留RNA，并加入1mL75%酒精（attention：75%酒精用DEP

13、C水配制），進(jìn)行離心（離心參數(shù)7500xg，5min，4），吸出所有液體，并室溫放置5-10min進(jìn)行干燥；加入20-50L去RNA酶水，于55-60水浴鍋中孵育10-15min，之后放于-80 凍存或進(jìn)行下一步實驗。1.4.3 RNA純度和濃度計算將提取的RNA稀釋100倍（去5l稀釋到500l），并用紫外分光光度計測試其在260nm和280nm處波長，其中OD260/OD280計算RNA純度（該值大于1.5方可進(jìn)行后續(xù)實驗，否則重新提取細(xì)胞，應(yīng)為1.82）；RNA濃度 = OD260 x 40 x 100（100為相應(yīng)的稀釋倍數(shù)），單位ng/L。1.4.4 反轉(zhuǎn)錄：需在冰盒上操作該步操作的

14、主要目的是將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過第3步計算得到的RNA濃度，取1gRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗。實驗體系為13L。依次加入1gRNA，1L Anchored-oligo（dT）18引(vial 5)物，剩余液體加水(vial 7)補滿；用反轉(zhuǎn)錄儀在65 下加熱10min；取出后立即放于冰上，依次加入4L vial 2，0.5L vial 3，2L vial 4, 0.5L vial 1，總體積從13L增加到20L；在用反轉(zhuǎn)錄儀在55下加熱30min；后立即85加熱5min，立即放于冰上或者-20凍存或進(jìn)行下一步實驗。1.4.5 qPCR進(jìn)行qPCR實驗前，先了解我們所用的gene primer

15、，首先reference gene 是Actin，target gene有Runx2，OCN，Col-I， ALP，BMP2，OPN共6種，其中primer分為兩管，分別標(biāo)記為F和R，進(jìn)行qPCR實驗時所用的反應(yīng)體系是10L，其中包括5L Mixture buffer，0.5L primer F，0.5L primer R，1L反轉(zhuǎn)錄后的cDNA（一般需將第4步得到的cDNA稀釋，稀釋倍數(shù)可為1x，10x，100x，須根據(jù)自己實驗體系摸索合適的濃度），3L RNA專用水。根據(jù)之前個人經(jīng)驗，可將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋10x進(jìn)行操作；此外，由于需要進(jìn)行3個復(fù)孔實驗，在用離心管加試劑時可先配制35L

16、的反應(yīng)體系(只配置30L不夠，液體溶解后體積縮小)，相應(yīng)的試劑應(yīng)為17.5L Mixture buffer，1.75L primer F，1.75L primer R，3.5L反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，10.5L RNA專用水。加好后進(jìn)行段時間離心(約5s)。將配好的反應(yīng)體系按照每孔10L分裝到96孔板(qPCR專用) ，并用膜封好96孔板，進(jìn)行離心(約5s)，離心好后進(jìn)行qPCR實驗。第二章細(xì)菌相關(guān)實驗2.1 細(xì)菌復(fù)蘇2.1.1 經(jīng)驗分享1. 15ml 離心管蓋子旋緊問題：大腸桿菌，厭氧，扭緊；金黃色葡萄球菌，耗氧，不扭緊2. 離心管使用前用紫外燈照射15min3. 實驗時只能使用P2代菌液4.

17、OD-0.1，細(xì)菌濃度約為通常使用的菌液濃度 1*108 CFU/mL，稀釋10倍后 1*107 CFU/mL2.1.2 實驗步驟1. 將菌液從-80度冰箱取出，放入超凈臺中解凍2. 培養(yǎng)基提前30min預(yù)熱（37度），在15ml離心管中加入10ml B型培養(yǎng)基（無瓊脂培養(yǎng)基）和0.1ml菌液，搖勻，放入37度烘箱、靜置5h3. 將菌液取出，用槍頭蘸菌液（200ul量程的槍頭）涂在含A型培養(yǎng)基（瓊脂培養(yǎng)基）的基板上（沿著波浪線，輕輕地，不劃破培養(yǎng)基），倒置放入37度烘箱15h4. 將10ml B型培養(yǎng)基加入15ml 離心管，37度預(yù)熱30min，取出基板，挑選單個菌落，用槍頭挑起，將槍頭連同細(xì)

18、菌放入離心管，搖勻，于37度烘箱中放置5h6-8 h（注意：挑菌落時，兩次，有2個15ml 離心管，一個用于實驗，一個用于備用。備用的于37度培養(yǎng)5h后放于4度冰箱即可，此時的菌液為P1代）5. 重復(fù)步驟36. 重復(fù)步驟4，這時挑1-3個菌落，2管備用，得到P2代7. 都放置于4度冰箱保存8. 用后的涂板放于4度冰箱保存2.2抗菌實驗及方法2.2.1 溶液配制1. 大腸桿菌(E. Coli) 配制LB瓊脂板：（10g胰蛋白胨+5g酵母提取物+10g氯化鈉），搖勻后加入12g瓊脂，繼續(xù)搖勻，定容至1L，高溫高壓滅菌，倒板。1L培養(yǎng)基約可倒板60塊。2. 金黃色葡萄球菌(S.aureus)配制TS

19、B瓊脂板：30g TSB溶液搖勻后加入12g瓊脂，繼續(xù)搖勻，定容至1L，高溫高壓滅菌，倒板。2.2.2 細(xì)菌接種取200ul振蕩（10-30s）后的細(xì)菌（S.a/E.coli）原液加入15ml的離心管中，用1.8ml0.9%的Nacl稀釋10倍后，振蕩10-30s置于37的冰箱中培養(yǎng)(預(yù)熱)30min。取培養(yǎng)好的細(xì)菌稀釋液加入到裝有試樣的24#孔板中，每個孔板對應(yīng)60ul的細(xì)菌培養(yǎng)液，將種植好細(xì)菌的試樣置于37的冰箱中培養(yǎng)24h。（注意：種植細(xì)菌前需要在孔板之間的空隙中需要添加一定的0.9%Nacl）。2.2.3 細(xì)菌染色觀察1. 3ul PI+3ul GF（Green florescent nucleic acid stain）+2ml水配制染料（根據(jù)實際需要按照這個比例配制），取經(jīng)24h細(xì)菌培養(yǎng)好的試樣，生理鹽水清洗兩遍，每個樣品加入500ul配制的染料（常溫避光）處理15min后吸出，遮光放置干燥一段時間后，在蓋玻片上添加（抗熒光淬滅劑）（5ul每試樣），并將試樣置于涂有抗熒的蓋玻片上，然后用指甲油和孔板固定好試樣隨后進(jìn)行熒光觀察。（配置好的染料可常溫保存使用，PI和GF都需要遮光處理）。