豚鼠氣道平滑肌的急性分離及KATP通道單通道電流的記錄

1、豚鼠氣道平滑肌的急性分離及KATP通道單通道電流的記錄【摘要】 目的：建立急性分離豚鼠氣道平滑肌的方法，并初步分析ATP敏感鉀通道(KATP通道)單通道電流的性質(zhì)。方法：急性分離出豚鼠34級支氣管，并用鏈霉蛋白酶E分散氣道平滑肌細胞，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)的內(nèi)面向外式記錄方法，研究氣道平滑肌KATP通道單通道電學(xué)性質(zhì)。結(jié)果：成功記錄到電導(dǎo)為112.4±5.14 pS的、可被優(yōu)降糖所阻斷的KATP通道單通道電流。鉗制電壓在0-60 mV之間，通道電流無整流現(xiàn)象，且未見時間依賴性失活。結(jié)論：建立了急性分離豚鼠氣道平滑肌的方法，并成功記錄KATP通道單通道電流，為進一步研究氣道平滑肌KATP通道在

2、呼吸道疾病中的作用提供了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 氣道平滑肌; 急性分離; ATP敏感鉀通道; 單通道電流氣道平滑肌的主要作用是調(diào)節(jié)氣道的緊張度和口徑1。氣道平滑肌收縮是呼吸系統(tǒng)疾病中氣道阻力增高的主要原因之一。多種ATP敏感鉀通道(ATPsensitive potassium channel, 簡稱KATP通道)開放劑，如吡那地爾(pinacidil)2、克羅卡林(cromakalim)3，可以使氣道平滑肌松弛，并且這種作用能被KATP通道特異性阻斷劑優(yōu)降糖所阻斷。因此，KATP通道在調(diào)節(jié)氣道平滑肌的舒張和收縮中起著重要作用，但其單通道電學(xué)性質(zhì)一直未能闡明。本研究利用改進的氣道平滑肌分離方法分離細

3、胞，并用膜片鉗技術(shù)研究了氣道平滑肌KATP通道的單通道性質(zhì)，為進一步研究KATP通道在呼吸道疾病中的作用提供了基礎(chǔ)。2 / 141 材料和方法1.1 支氣管平滑肌細胞急性分離氣管組織制備和保持：取健康豚鼠(雌雄不分)，體重300400 g，用3%的戊巴比妥鈉鹽4 ml/kg腹腔麻醉后，取出氣管和肺組織，立即置于4 用95%O2+5%CO2飽和的HPSS液(成分(mmol/L)：NaCl 126，KCl 5，HEPES 10，CaCl2 2，MgSO4 2，DGlucose 10,pH7.3(NaOH)中。分離兩側(cè)肺組織中的34級支氣管。去除上皮細胞和外側(cè)面的結(jié)締組織和肺組織后，放入含10 ml

4、 HPSS液的浴槽底部平衡。內(nèi)含青霉素(20 U/L)和鏈霉素(20 g/ml)。溫度保持在32 ，通以95%O2+5%CO2混合氣。分離支氣管平滑肌細胞： 取3 ml HPSS液和4.5 mg鏈霉蛋白酶E(Pronase E)放入10 ml離心管中，將切成1 mm2的支氣管組織放入底部，上方通以混合氣，溫度37 ，pH7.4。消化3040 min后洗去殘余酶。在HPSS液中，用針頭將氣管組織分離成絲狀，在常溫下分別用尖端拋光處理的直徑為300 m和150 m的Pasteur吸管連續(xù)吹打，使組織分散，細胞游離。取上部細胞懸液，置于HPSS液中，放在4 冰箱保存，供6 h內(nèi)使用。整個消化過程需通

5、以95%O2+5%CO2混合氣。實驗時，取細胞懸液加到培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上，此蓋玻片事先涂有0.1%的多聚賴氨酸。靜置10 min后，加入2ml HPSS液洗去蓋玻片上多余的組織碎片和未附著在蓋玻片上的細胞。鏡下觀察細胞形態(tài)。通道記錄僅選用細胞膜完整、有立體感、胞體呈梭形的細胞。1.2 單離子通道記錄與分析采用膜片鉗技術(shù)的內(nèi)面向外式。浴槽液成分為(mmol/L)：KCl 140，CaCl2 1，NaCN 2，HEPES 10。電極液成分為(mmol/L)：KCl 140，CaCl2 2，MgCl21，TTX0.001，CdCl20.3，HEPES 10。加入TTX和CdCl2的目的在于分別阻斷電

6、壓依賴性Na+和Ca2+通道。通過通道可被優(yōu)降糖(10 mol/L)所阻斷，確定為ATP敏感鉀通道。在實驗之前，所有溶液的pH值均調(diào)到7.2，并用0.22 m的醋酸纖維微孔濾膜過濾，以除去灰塵顆粒和細菌。實驗在室溫下進行(2127 )。記錄用微電極尖端直徑約為0.51 m，內(nèi)灌電極液后，電阻為816 M。內(nèi)插乏極化氯化銀電極與膜片鉗放大器探頭相連。單通道電流用膜片鉗放大器(CEZ2200，日本光電)放大，放大器探頭反饋電阻為10 G，低通濾波器濾波頻率為3 kHz，用四道磁帶錄音機(RMG5204，Kohden)記錄資料。將記錄在磁帶上的電信號，經(jīng)帶有TL1125接口的125 kHz Labm

7、aster DMA數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和pCLAMP 5.5.1版電信號采集程序(Axon Instrument，美國)資料輸入計算機，用pCLAMP分析程序Fetchan測量通道電流幅度和時程。將測量獲得的資料轉(zhuǎn)入pCLAMP的Pstat程序作統(tǒng)計處理。1.3 資料分析數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示。參數(shù)比較是在應(yīng)用方差齊性檢驗后，用t檢驗進行分析，P<0.05為差異顯著。2 結(jié)果2.1 單通道電流實驗中，浴槽液和電極液均使用高鉀液(K+濃度為140 mmol/L)。因此，當(dāng)細胞內(nèi)面向外式記錄形成后，膜內(nèi)側(cè)面對浴槽液，此時K+平衡電位Ek為0 mV，電極下膜片的跨膜電位Vm=-Vp

8、。當(dāng)Vp=0 mV時，未能記錄到任何通道活動;若在此基礎(chǔ)上去極化，便可記錄到外向通道電流。電流幅度在同一鉗制電壓下基本相同，呈時間不等的方波。其幅度分布直方圖呈對稱的單峰狀，能很好地進行正態(tài)分布擬合。表1顯示的是不同鉗制電壓下單通道電流幅度的算術(shù)均數(shù)與正態(tài)擬合值的對比情況，其P值均大于0.2，表明兩者無明顯差異。說明通道電流為單通道電流。另外，無論開放時程長短，通道電流幅度基本一致。表1 單通道電流幅度算術(shù)均值與擬合均值的比較2.2 單通道電導(dǎo)外向電流隨去極化程度增大，表現(xiàn)為幅度增高。以Vp(mV)為橫坐標，相應(yīng)的通道外向電流幅值(pA)為縱坐標，可見在0-60 mV范圍內(nèi)，各點基本排列在一傾

9、斜的直線上，說明通道無整流。應(yīng)用直線回歸畫出最佳擬合直線(圖1，R=0.999，P<0.05)，此即電流電壓關(guān)系曲線(IV Curve)，電導(dǎo)值由該曲線斜率所決定。該通道的電導(dǎo)為112.4±5.14 pS(n=6)。IV曲線與X軸相交處的電壓值即為翻轉(zhuǎn)電位，本組通道翻轉(zhuǎn)電位為1.1 mV，與理論值0 mV極為接近。(數(shù)據(jù)顯示的是其中一例細胞記錄的結(jié)果)圖1 KATP 通道內(nèi)面向外式記錄的電流電壓關(guān)系曲線2.3 通道激活與去極化時間關(guān)系在記錄到的所有通道活動中，無論膜去極化程度大小，60 s內(nèi)通道的電導(dǎo)、開放概率均無明顯變化，長者甚至在90 min內(nèi)通道活動仍無明顯變化。

10、3 討論本實驗從急性分離的單個豚鼠氣道平滑肌細胞上記錄到的單通道電流，在鉗位電壓一定時，電流幅度均一，呈均勻的正態(tài)分布，是單通道電流。由于電極液中含有鈣通道阻斷劑CdCl2，阻斷了電壓依賴性鈣通道;有TTX，阻斷了Na+通道，由此排除了鈉通道與鈣通道電流的干擾;通道電流在去極化時為外向電流，且幅度隨去極化加大而增大;內(nèi)面向外式記錄膜內(nèi)外鉀離子濃度相等時，通道翻轉(zhuǎn)電位為0 mV，與實驗狀態(tài)下的鉀離子平衡電位一致，說明通道對K+選擇性通透。再結(jié)合KATP通道特異性阻斷劑優(yōu)降糖對通道電流的阻斷作用，確定該通道為KATP通道。本實驗參照文獻中的方法4，并針對豚鼠氣道平滑肌的特點進行了改良，成功對豚鼠氣

11、道平滑肌急性分離，獲得了適用于膜片鉗研究的單個氣道平滑肌細胞。由于在完整細胞上，胞內(nèi)ATP可抑制通道的活動，因此在完整細胞上難以記錄到KATP通道的單通道活動。實驗中，我們采用了浴槽內(nèi)加入NaCN的方法抑制細胞代謝，并使用膜片鉗內(nèi)面向外式記錄方式，最大限度地去除了胞內(nèi)ATP的影響，成功記錄到KATP通道的活動，并對其單通道電學(xué)性質(zhì)進行了初步研究。在本實驗的過程中也發(fā)現(xiàn)，正常豚鼠氣道平滑肌上能記錄到的KATP通道活動較少。究其原因，可能是由于平滑肌細胞KATP通道密度很低(如肺動脈平滑肌KATP通道電流噪音分析表明單個細胞只有300400個通道，即大約每10 m2一個通道5)，記錄到單通道的概率

12、較低。KATP通道具有多樣性或異質(zhì)性，單通道電導(dǎo)的變化很大。平滑肌KATP通道大致可分為小到中電導(dǎo)(在平衡鉀液中電導(dǎo)值1550 pS)和大電導(dǎo)(在平衡鉀液中電導(dǎo)值130 pS以上)兩類6。本研究發(fā)現(xiàn)豚鼠氣道平滑肌KATP通道電導(dǎo)較大，為112.4±5.14 pS。通道電導(dǎo)的不同，可能與通道組織來源和實驗條件及記錄方式不同所致。一般來說，KATP通道開放可使細胞膜超極化、引起電壓依賴性Ca2+通道的關(guān)閉，激動劑誘導(dǎo)的三磷酸肌醇(IP3)合成減少，收縮器對Ca2+敏感性降低，進而松弛氣道平滑肌及血管平滑肌6。在以往的實驗中，人們觀察到某些鉀通道開放劑(如吡那地爾、克羅卡林)在氣道平滑肌上

13、可產(chǎn)生松弛作用，并且這種作用可被優(yōu)降糖所阻斷，因此推斷KATP通道在氣道平滑肌上起著重要的作用2,3。但對氣道平滑肌的KATP通道的單通道性質(zhì)一直不是很清楚。本研究填補了相應(yīng)空白，為進一步研究KATP通道在呼吸道疾病中的作用提供了基礎(chǔ)。【參考文獻】 1Mitchell HW. Airway smooth muscle contractionperspectives on past, present and future. Pulm Pharmacol Ther, 2009,22(5): 363369.2 Sutovska M. Nosalova G, Franova S. The role o

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