大鼠胃促黃體生成素及其受體的免疫組化及原位雜交研究(一)(精)

1、大鼠胃促黃體生成素及其受體的免疫組化及原位雜 交研究（一）【摘要】 目的：探討大鼠胃組織中是否表達(dá)促黃體生成素（LH 及其受體 （LHR）,為進(jìn)一步研究 LH 對胃的功能調(diào)節(jié)提供理論依據(jù).方法：采用免疫組織 化學(xué) SABC 和原位雜交的方法進(jìn)行研究.結(jié)果：在大鼠胃底腺的壁細(xì)胞和主細(xì) 胞呈 LH 和 LHR 免疫反應(yīng)陽性.陽性物質(zhì)分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，細(xì)胞核呈陰 性反應(yīng).上述細(xì)胞同樣含有 LH 和LHR mRN 雜交信號，信號物質(zhì)亦分布于細(xì)胞 質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核呈陰性反應(yīng).結(jié)論：大鼠胃壁細(xì)胞和胃主細(xì)胞既能產(chǎn)生 LH,又 能表達(dá) LHR 說明 LH 對胃壁細(xì)胞和胃主細(xì)胞功能作用可能是通過旁分泌或自分

2、泌的作用來實現(xiàn)的【關(guān)鍵詞】黃體生成素免疫組織化學(xué)原位雜交胃底腺0 引言LH（luteinizing hormone, LH） 及其受體（luteinizing hormone receptor,LHR）可以在下丘腦-垂體-性腺軸之外表達(dá)已經(jīng)被公認(rèn).我們先前的實驗已經(jīng)證明，大鼠頜下腺的漿液性腺泡上皮細(xì)胞能夠表達(dá)LH 及其受體1-2，但作為消化系統(tǒng)最重要器官之一的胃組織是否表達(dá)LH 及其受體，目前尚未闡明，本實驗采用免疫組織化學(xué)和原位雜交等技術(shù)對該問題進(jìn)行了研究1 材料和方法1.1 材料正常雄性 SD 大鼠，體質(zhì)量（200 土 20） g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)試驗 動物中心；LH mAb 購自美國 Z

3、YME 公司；LHR 多克隆抗體、SABC 式劑盒與敏感 性加強型原位雜交檢測試劑盒I型為武漢 BOSTE 公司產(chǎn)品；Vector 購自 TaKaRa 公司；地高辛標(biāo)記隨機引物標(biāo)記試劑盒購自Roche; Hi ndIH，EcoRI 內(nèi)切酶購自 New England Biolabs 公司；膠回收試劑盒購自 Promega 公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中山試劑公司.1.2 方法1.2.1LH 及其受體的免疫組織化學(xué) SABC 法 SD 大鼠術(shù)前晚禁食不禁水，經(jīng) 腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg ）麻醉，取出胃組織立即放入 Bouins 液中固 定，用石蠟包埋后將組織蠟塊切成 4 mm 的

4、切片，并將切片貼附于 APES 處理過 的載玻片上，烘干備用將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，先后各 10 min，無水乙醇 5 min，加入 30 g/L 甲醇中 20 min 以去除內(nèi)源性過氧化物酶，然后按SABC 法進(jìn)行 LH 及其受體的免疫組織化學(xué)染色，第一抗體： LH 抗體（1 : 500 稀釋）和 LHR 抗體（1 : 300 稀釋），在 4C冰箱孵育過夜，第二抗體：LH 和 LHR 分別為生物素標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔 IgG （1 : 200 稀釋）， 室溫孵育 2 h. SABC 復(fù)合物 （1 :200 稀釋）室溫孵育 30 min. DAB 顯色 1015 min，蒸餾水終止反應(yīng)，剃度乙醇

5、脫水，透明二甲苯兩次，各 10 min，中性樹膠封片.用正常兔血 清取代第一抗體進(jìn)行孵育作陰性對照1.2.2LH 及其受體的標(biāo)記探針根據(jù)文獻(xiàn)2產(chǎn)生的克隆制備探針，分別從 LH 及其受體的上切下最初的 DNA 片段，長度分別為 150，650 bp，并進(jìn)行回收，采用隨即引物標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，具體方法按Roche 公司的地高辛標(biāo)記試劑盒進(jìn)行：用滅菌去離子蒸餾水稀釋1 卩 g DNA 至總體積 16卩 L;把 DNA 瓦置于沸水中，水浴 10 min.然后，迅速冰浴 3 min 以上，使 DNA 熱變性；加 4 卩 L DIG Random Labeling Mix（ 高效），混勻后再 1000 g

6、離心 5 min，置 37C水浴反應(yīng)過夜， 時間越長， 產(chǎn)量越高.延長反應(yīng)時間至 20 h 可明 顯增加地高辛標(biāo)記 DNA勺產(chǎn)量，并加入 0.2 mmol/L EDTA 2 卩 L 以終止反應(yīng)， 置-20C保存?zhèn)溆?1.2.3LH 及 LHR mRN 原位雜交程序用上述方法麻醉動物后，取出胃組織立 即放入用 Bouins 液（內(nèi)含 1g/L DEPC）中固定，整個制片過程均防 RNA 酶污 染，切片厚度為 4 卩 m 將切片進(jìn)行二甲苯脫蠟，先后各 15 min,剃度乙醇水 化，加入 30 g/L 甲醇中 20 min 以去除內(nèi)源性過氧化物酶；胃蛋白酶活性 37C消化 30 s，以增加探針的穿透

7、力；4 g/L 多聚甲醛終止反應(yīng) 5 min，以 終止蛋白酶 K 的作用；每張切片滴加含 2.0 mg/L 地高辛標(biāo)記探針的原位雜交液 30 卩 l，置濕盒中 42C雜交 20 h ;分別用 37C預(yù)熱的 2XSSC 0.1XSSC 洗滌 5 minX3，10 minX2;滴加小鼠抗地高辛抗體 37C，2 h，0.5 mol/L TBS 洗 滌 5 minX3;滴加生物素化羊抗小鼠 IgG 37C1 h，0.5 mol/L TBS 洗滌 5 minX3;滴加 ABC 37C30 min. 最后用 DAB顯色液顯色，室溫 1015 min， 鏡下觀察其顯色情況，水洗終止反應(yīng).梯度乙醇脫水，中性樹

8、膠封片.陰性對 照分別用不含探針的雜交緩沖液取代含探針的雜交液，及用正常羊血清取代羊 抗地高辛抗體 IgG 進(jìn)行孵育.2 結(jié)果2.1LH 及 LHR 免疫組織化學(xué)結(jié)果 LH 及 LHR 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞呈棕黃色，背 底不著色，反差明顯，陽性細(xì)胞很易鑒別，兩種陰性對照實驗均呈陰性反應(yīng).大鼠胃小凹上皮細(xì)胞呈 LH 與 LHR 免疫反應(yīng)陰性，而在胃底腺壁細(xì)胞、主細(xì)胞均 呈陽性反應(yīng)， 陽性物質(zhì)分布于細(xì)胞質(zhì)， 細(xì)胞核呈陰性分布， 但粘液細(xì)胞均呈陰 性反應(yīng) （圖 1） .2.2LH 及 LHR mRN 原位雜交 LH 及 LHR mRN 雜交信號的細(xì)胞也呈棕黃色， 背底不著色，反差明顯，陽性細(xì)胞很易辨認(rèn)，

9、陰性對照試驗呈陰性反應(yīng).在大鼠胃 LH 及 LHR mRN 雜交信號分布一致，陽性信號物質(zhì)主要位于胃底腺壁細(xì) 胞、主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核呈陰性，但粘液細(xì)胞內(nèi)的雜交信號均呈陰性反 應(yīng)（圖 2）.胃壁細(xì)胞（T）和主細(xì)胞（*）呈 LH 免疫反應(yīng)陽性，陽性物質(zhì)分布于細(xì)胞 質(zhì)，細(xì)胞核呈陰性分布.圖 1 大鼠胃底腺 LH 免疫組織化學(xué)染色 SABCX200 （略）陽性物質(zhì)位于胃壁細(xì)胞(T)和主細(xì)胞(*)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞核呈陰性.圖 2 大鼠底腺 LH mRNA 雜交信號 DABX400 (略)3 討論傳統(tǒng)認(rèn)為 LH 和絨毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin, CG)分別是由腺垂體嗜

10、堿性細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞所分泌的糖蛋白，二者具有相似的立體結(jié) 構(gòu)，并與表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF) 、神經(jīng)生長因子 (nerve growth factor,NGF)等屬于同一個超家族，因此 LH 和 CG 除了傳統(tǒng)的內(nèi)分泌作用外，它們也具有生長因子的特性近年來的許多研究表明，LH 及其 受體可存在于腦垂體之外，如前列腺3、卵巢4、睪丸5及頜下腺2等組織，這說明 LH 也可能異位合成并通過旁分泌或自分泌效應(yīng)調(diào)節(jié)不同 類型細(xì)胞的功能這與本實驗的研究結(jié)果是相一致的胃壁細(xì)胞是一種多功能的細(xì)胞，既能分泌多種生物活性物質(zhì)，又有多種生 物活性物質(zhì)的受體的表達(dá)6.我

11、們先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胃壁細(xì)胞既能表達(dá) GnRr 又能表達(dá)GnRH 受體7，并且 GnRH 類似物對胃酸的分泌起一定的抑制 作用.我們近來的研究也發(fā)現(xiàn)8，胃壁細(xì)胞的促卵泡激素受體免疫反應(yīng)呈陽性，并認(rèn)為 FSH 對大鼠胃底腺壁細(xì)胞的功能可能有一定的調(diào)節(jié)作用本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胃壁細(xì)胞LH 及 LH 受體免疫反應(yīng)呈陽性，提示該處可能存在的調(diào)節(jié)軸，對胃壁細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，但是它究竟起哪種功能起調(diào)節(jié)作用有待進(jìn)一步研究加以證 實胃主細(xì)胞是胃底腺中數(shù)量最多的細(xì)胞，其最主要的功能是分泌胃蛋白酶原近年來的研究表明，胃主細(xì)胞也是一種功能較多的細(xì)胞，如在主細(xì)胞上可表達(dá) 轉(zhuǎn)化生長因子(transforming grow

12、th factor, TGF)和 EGF 受體，主細(xì)胞可以通過鄰近壁細(xì)胞的旁分泌作用產(chǎn)生的 EGF 來調(diào)節(jié)壁細(xì)胞的9數(shù)量，還可以通過 EFG來調(diào)節(jié)胃脂肪酶的活性，其作用途徑可能是通過有絲分裂蛋白激酶p42/44來實現(xiàn)的10本研究中發(fā)現(xiàn)，胃主細(xì)胞 LH 及 LH 受體均呈免疫反應(yīng)陽性， 因此推測 LH 可能對主細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，其作用途徑也可能是通過鄰近壁細(xì) 胞的旁分泌作用，或是通過自分泌效應(yīng)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長及功能，但有待于進(jìn) 一步實驗加以證實【參考文獻(xiàn)】1付建芳，黃威權(quán),王世鄂，等大鼠下頜下腺卵泡刺激素、黃體生 成素的分布及與促性腺激素釋放激素受體的共定位研究J解剖學(xué)報，2004, 35(6

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