HE染色方法與步驟吐血整理

1、HE染色試劑配置A：0.51%的伊紅酒精溶液：稱(chēng)取伊紅Y0.51g，加少量蒸餾水溶解后，再滴加冰醋酸直至漿糊狀。以濾紙過(guò)濾，將濾渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工業(yè)酒精，如果不怕浪費(fèi)，用無(wú)水乙醇配制也可）100毫升溶解。B：蘇木素染液配方：(配制3000ml，可按比列減少)蘇木精6g無(wú)水乙醇100ml硫酸鋁鉀150g蒸餾水2000ml碘酸鈉1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：將蘇木素溶于無(wú)水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶解后將甘油傾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸鈉。C：1%鹽酸酒精分化液：將1毫升濃鹽酸加入99毫升70%酒精中即可。染色流程(1)二甲苯（）15min(2)二甲

2、苯（）15min（3）二甲苯：無(wú)水乙醇=1:12min(4)100%乙醇（）5min(5)100%乙醇（）5min(6)80%乙醇5min(7)蒸餾水5min(8)蘇木精液染色5min(9)流水稍洗去蘇木精液1-3s(10)1%鹽酸乙醇1-3s(11)稍水洗10-30s(12)蒸餾水過(guò)洗1-2s(13)0.5%伊紅液染色1-3min(14)蒸餾水稍洗1-2s(15)80%乙醇稍洗1-2s(16)95%乙醇（）2-3s(17)95%乙醇（）3-5s(18)無(wú)水乙醇5-10min(19)石炭酸二甲苯5-10min(20)二甲苯（）2min(21)二甲苯（）2min(22)二甲苯（）2min(23)

3、中性樹(shù)膠封固注：第（11）、（12）步可省去，（13）步?jīng)_水時(shí)間需延長(zhǎng)至20-30min。第（21）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用無(wú)水乙醇。*冷凍切片HE染色步驟：（1）冰凍切片固定1030s（2）稍水洗12s（3）蘇木精液染色（60）3060s（4）流水洗去蘇木精液510s（5）1%鹽酸乙醇13s（6）稍水洗12s（7）促藍(lán)液返藍(lán)510s（8）流水沖洗1530s（9）0.5%曙紅液染色3060s（10）蒸餾水稍洗12s（11）80%乙醇12s（12）95%乙醇12s（13）無(wú)水乙醇12s（14）石炭酸二甲苯23s（15）二甲苯（）23s（16）二甲苯（）23s（17）中性樹(shù)膠封固。注：第（1

4、4）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用無(wú)水乙醇。染色結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)色，胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈深淺不一的紅色。412切片脫水透明切片經(jīng)HE染色后，要徹底脫水透明，才能用中性樹(shù)膠封蓋。如果脫水不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下觀察模糊不清，且容易褪色。切片1-2級(jí)無(wú)水乙醇脫水，也可使用石碳酸二甲苯進(jìn)行脫水。石碳酸有較強(qiáng)脫水能力，但長(zhǎng)時(shí)間可使切片脫色，因此要經(jīng)過(guò)多次二甲苯以使石碳酸完全除去。5.H-E染色評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：（1）切片完整，厚度4-6微米，厚薄均勻，無(wú)皺褶無(wú)刀痕；（2）染色核漿分明，紅藍(lán)適度，透明潔凈，封裱美觀。4 染色結(jié)果 編輯細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液

5、呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。著色情況與組織或細(xì)胞的種類(lèi)有關(guān)，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，很多細(xì)胞在新生時(shí)期胞漿對(duì)伊紅著色較淡或輕度嗜堿，當(dāng)其衰老時(shí)或發(fā)生退行性變則呈現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時(shí)，伊紅著色由淺變深。Masson染色,用于顯示組織中纖維的染色方法之一。試劑：Regaud 氏蘇木精：蘇木精1g，95%酒精10ml，甘油10ml，蒸餾水80ml。將蘇木精加入蒸餾水內(nèi)加溫溶解,冷卻后加入酒精和甘油,放數(shù)日后即可應(yīng)用。Masson麗

6、春紅酸性復(fù)紅液： 麗春紅0.7g，酸性復(fù)紅0.3g，蒸餾水99ml，冰醋酸1ml。0.2%冰醋酸水溶液： 冰醋酸0.2 ml，蒸餾水100 ml。1%磷鉬酸水溶液：磷鉬酸1g，蒸餾水100 ml。苯胺藍(lán)水溶液：苯胺藍(lán)2g，蒸餾水98 ml，冰醋酸2 ml。1%光綠水溶液：光綠 1g，蒸餾水100 ml。Masson三色法步驟1 石蠟切片脫蠟至水。2 鉻化處理或去汞鹽沉淀（甲醛固定的組織此步可略）。3 依次自來(lái)水和蒸餾水洗。4 用Regaud蘇木精染液或Weigert蘇木精液染核5-10min。5 充分水洗,如過(guò)染可鹽酸酒精分化。6 蒸餾水洗。7 用Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液5-10min。

7、8 以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。9 1%磷鉬酸水溶液分化3-5min。10. 不經(jīng)水洗,直接用苯胺藍(lán)或光綠液染5min。11以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。1295%酒精、無(wú)水酒精、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。結(jié)果：膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色（如光綠液染色為綠色），胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核黑藍(lán)色。體會(huì)與說(shuō)明：1控制好染色步驟。2組織固定起著很重要的作用，根據(jù)不同的固定液可延長(zhǎng)或縮短染色時(shí)間。30.2%冰醋酸水溶液洗，可使色調(diào)清晰鮮艷。4 磷鉬酸水溶液對(duì)麗春紅、酸性復(fù)紅有分化作用，分化時(shí)鏡下控制， 肌纖維和纖維素呈紅色，膠原纖維呈淡粉紅色即可。天狼猩紅染色試劑配制(1)天狼星紅飽和

8、苦昧酸液 O5天狼星紅10ml，苦味酸飽和液90ml。(2)天青石藍(lán)液 天青石藍(lán)B125g鐵明礬125g，蒸餾水250ml。溶解煮沸、待冷卻過(guò)濾加入甘油30ml，然后再加入濃鹽酸05ml。染色步驟(1)中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。(2)人大青石藍(lán)液染5一lOmin。(3)蒸餾水洗3次。(4)天狼星紅飽和苦昧酸濃染15-30min(5)無(wú)水乙醇直接分化與脫水。Devil二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。注意事項(xiàng)(1)細(xì)胞核里染色可以用Harris蘇木素染色液談染。(2)染色封固后的切片，須及時(shí)用偏光顯微鏡進(jìn)行觀察和照相已保持鮮艷的色彩注：在偏光顯微鏡下可以觀察到四種類(lèi)型的膠原纖維。l型膠

9、原纖維：緊密排列，顯示很強(qiáng)的雙折光性，呈黃色或紅色的纖維oll型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈多種色彩的疏松網(wǎng)狀分布。皿型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈綠色的細(xì)纖維。lv型膠原纖維：顯示弱的雙折光的基膜，呈淡黃色。免疫組化步驟（ABC法）1。4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4）中過(guò)夜。蠟塊制作。切片，貼片。0.01MKPBS清洗5min×3后； 2。加入配好的0.3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml0.01MKPBS 100ml30%過(guò)氧化氫）30min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5min×3； 3。加入配好的0.3% Triton X

10、100（30% Triton X1000.01MKPBS 100ml）30min，以增加細(xì)胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3； 4。加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g0.01MPBS 100ml疊氮納0.08g）稀釋的一抗，4存放24-48h；吸去抗體，0.01MKPBS洗5min×3； 5。加入0.01MKPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3； 6。加入ABC復(fù)合物之類(lèi)的抗體，室溫孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸餾水迅速?zèng)_三次； 7。加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時(shí)間一般不超過(guò)30min

11、，可不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入0.01MKPBS終止反應(yīng)； 8。梯度酒精脫水之后，封片，拍照。 免疫組化SP法步驟：SP(streptavidin-perosidase)法,即鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法.按標(biāo)記物質(zhì)的種類(lèi)，如熒光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法等。按染色步驟可分為直接法(又稱(chēng)一步法)和間接法(二步、三步或多步法)；按結(jié)合方式可分為抗原抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)

12、氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。 一般的sp法步驟啊,具體如下：1.烤片，68，20分鐘,2. 常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯I 20min -二甲苯II 20 min-100%酒精I(xiàn) 10min -100%II 10min -95% 5min- 80% 5min- 70% 5min 3.阻斷 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H2O2 37孵育10min，PBS沖洗3X5min；4. 抗原修復(fù):置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0）中用煮沸（95，1520min），自然冷卻20min 以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室

13、溫，PBS沖洗3X5min。5. 正常羊血清工作液封閉，3710 min，傾去勿洗.6. 滴加一抗4 冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3X5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）；滴加生物素標(biāo)記二抗, 37孵育30min, PBS沖洗3X5min;7. 滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37孵育30min, PBS沖洗3X5min;8. DAB/ H2O2反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。免疫組化（Elivision二步法）：（1）石蠟切片置于67烘箱中，烘片2小時(shí)，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3）。（2）取一定量p

14、H=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3。(注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的，視具體情況而定)（3）每張切片加1滴3% H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3。（4）除去PBS液，每張切片加1滴相應(yīng)的第一抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)），室溫下孵育2小時(shí)。（5）PBS沖洗3×5。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），室溫下孵育20分鐘

15、。PBS沖洗3×3。（6）除去PBS液，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物（試劑B），室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5（7）除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液，顯微鏡下觀察5分鐘。（8）蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來(lái)水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，晾干后觀察。注：即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒，購(gòu)自福州脈新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。包括：生物素化抗兔二抗、親和素（Reagent A）、生物素辣根過(guò)氧化物酶（Reagent B）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）脫鈣劑的配置10%EDTA的配置：1)      加熱水浴鍋到652)      稱(chēng)取NaOH11g加到900ml dd H2O中3)      再加入EDT A-Na