紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定

1、GB/T xxxx xxxxxxxx食品安全國家標準紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定 （征求意見稿）xxxx-xx-xx實施xxxx-xx-xx發(fā)布中華人民共和國衛(wèi)生部 發(fā)布中華人民共和國衛(wèi)生部 發(fā)布1.1.1.1 2010-06-01實施2010-××-××發(fā)布 前 言本標準代替GB 5009.222-2008。本標準與GB 5009.222-2008相比，主要變化如下： 修改了標準的中文名稱，標準中文名稱改為食品安全國家標準 紅區(qū)類產(chǎn)品中桔青霉素的測定（理化方法）；按照GB/T20001.4-2001對原標準的結(jié)構(gòu)進行了修改。食品安全國家標準紅曲類產(chǎn)品中桔

2、青霉素的測定1 范圍本標準規(guī)定了紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定方法。本標準適用于紅曲米、紅曲紅（固態(tài)、液態(tài)）、紅曲發(fā)酵液和用紅曲菌生產(chǎn)的保健食品中桔青霉素的測定。2 原理液態(tài)紅曲類樣品經(jīng)乙醇提取、離心、過濾后經(jīng)高效液相色譜儀（HPLC）分析；固態(tài)紅曲類樣品經(jīng)甲苯-乙酸乙酯-甲酸提取、超聲波萃取、離心、過濾后經(jīng)HPLC分析，外標法定量。3 試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682中規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。3.1.2 磷酸（H3PO4）：色譜純。3.1.3 甲醇（CH3OH）：色譜純。3.1.4 甲苯（C6H5CH3）。3.

3、1.5 乙酸乙酯（C4H8O2）。3.1.6 甲酸（CH2O2）。3.1.7 無水乙醇（C2H5OH）：色譜純。3.2 試劑配制 復(fù)合萃取劑（TEF）：甲苯乙酸乙酯甲酸（7+3+1），配制方法是將7份體積的甲苯（3.5）、3份體積乙酸乙酯（3.1.5）和1份體積酌甲酸（3.1.6）混合而成。3.3 標準品 桔青霉素（C13H14O5）標準品：純度>99%。3.4 標準溶液制備3.4.1 桔青霉素標準貯備溶液（50 mg/L）：準確稱取桔青霉素標準品，用甲醇溶解并定容至濃度為50 mg/L，密封后4 冰箱避光保存。3.4.2 桔青霉素標準工作溶液（5 mg/L）：用甲醇將10mL的50 m

4、g/L桔青霉素標準貯備溶液定容至100 mL，密封后4 冰箱避光保存，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。工作液從冰箱取出后應(yīng)于室溫下至少放置10 min，渦旋混勻后方可使用。3.4.3 桔青霉素標準曲線工作液：將標準儲備液用甲醇系列稀釋后，配成濃度為0.1 mg/L、0.25 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L的標準曲線工作溶液。4 儀器和設(shè)備4.1 高效液相色譜儀，配有熒光檢測器。4.2 超聲波細胞破碎儀。4.3 電子天平（感量0.0001 g）。4.4 pH計（精度0.01）。4.5 勻漿器。4.6 離心機。4.7 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。4.8 微孔有機濾膜（孔徑0.45 µm）。4.9

5、數(shù)顯恒溫水浴鍋（溫度精度土1 ）。4.10 渦旋混勻器。4.11 磁力攪拌器。5 分析步驟5.1試樣制備 5.1.1 液態(tài)紅曲樣品將帶有菌絲體的液態(tài)發(fā)酵紅曲樣品勻漿后用吸量管吸取10 mL（液態(tài)紅曲紅樣品直接取樣10 mL），置于50 mL具塞試管中，加入20 mL無水乙醇，60 水浴加熱1 h（期間不斷振搖），冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入塑料離心管中，3 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.45 µm濾膜過濾后進行HPLC分析。5.1.2 固態(tài)紅曲制品用電子天平（4.3）準確稱取一定量固態(tài)紅曲樣品（色素用紅曲米為2 g，用紅曲菌生產(chǎn)的保健食品為3 g，釀酒用曲為3 g）于50 mL

6、具塞比色管中，加入20 mL TEF溶液（3.2），超聲提取10 min（強度40%，工作5 s，間隔5 s），3 000 r/min離心20 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL具塞試管中，殘渣用15 mL TEF溶液（3.2）同上述步驟再提取兩次，合并三次提取上清液于50 mL具塞比色管中，40真空濃縮（4.7）至干后加入30 mL甲醇溶解，經(jīng)微孔有機濾膜（4.8）過濾后進行HPLC分析。準確稱取1g粉狀紅曲紅或紅曲黃色素祥品，在磁力攪拌下緩緩加到盛有20 mL TEF溶液（3.2）的燒杯中，繼續(xù)攪拌30 min后，3 000 r/min離心20 min，以下按固態(tài)紅曲樣品同樣的方法自“上清液轉(zhuǎn)入

7、50 mL具塞試管中”起，依法操作。5.2 分析步驟5.2.1 液相色譜分析條件 a）色譜柱：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，粒度5 µm）； b）柱溫：28 ； c）流動相：乙腈（3.2）+水=35+65，水用色譜純磷酸（4.3）調(diào)pH至2.5； d）流速：1.0 mL/min； e）檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長331 nm，發(fā)射波長500 nm； f）進樣量：20 µL。5.2.2 色譜分析分別將20 pL不同質(zhì)量濃度（0.1 mg/L、0.25 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L）的桔青霉素標準溶液（3.10.3）及制備后的樣品溶

8、液（5.1）注入液相色譜儀中，以保留時間定性，以桔青霉素質(zhì)量濃度與相對應(yīng)的峰面積繪制工作曲線，獲得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，以此計算樣品中的桔青霉素含量。 由于HPLC分析中采用了熒光檢測器，樣品中的雜質(zhì)對桔青霉素的出峰基本無干擾，因此一般情況下無需確證，必要時用液相色譜質(zhì)譜進行確證，條件如下： a）毛細管電壓：3.78 kV； b）錐孔電壓：30 V； c）射頻透鏡電壓：0.5 V； d）萃取錐孔電壓：5 V； e）離子源溫度：100 ； f）脫溶劑氣溫度：250 ； g）脫溶劑氣流量：320 L/h； h）電子倍增電壓：650 V； i）相對分子質(zhì)量范圍：100500。 桔青霉素的液相色譜圖

9、參見附錄A，質(zhì)譜圖參見附錄B。5.3 標準曲線的制作將標準系列工作液分別注入液相色譜儀中，測定相應(yīng)的響應(yīng)值，以標準工作液的濃度為橫坐標，以響應(yīng)值（如：峰面積、峰高、吸收值等）為縱坐標，繪制標準曲線。5.4 平行試驗將試樣溶液注入液相色譜儀中，得到相應(yīng)的響應(yīng)值，根據(jù)標準曲線得到待測液中桔青霉素的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。6 分析結(jié)果的表述6.1固態(tài)樣品中桔青霉素的含量按式（l）計算： 式中： c1樣品中桔青霉素含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c儀器檢測的質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；V最終定容體積，單位為毫升（mL）；m樣品質(zhì)量，單位為克（g）。6.2液態(tài)樣品中桔青霉素的含量按式（2）計算： 式中：c2樣品中桔青霉素含量，單位為毫克每升（mg/L）；c儀器檢測的質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；V2最終定容體積，單位為毫升（mL）；V1移取的樣