基因工程的原理和技術

1、第二節(jié) 基因工程的原理和技術基因工程的原理和技術一、教學目標：一、教學目標：1.了解基因工程的基本原理。了解基因工程的基本原理。2.描述重組描述重組DNA技術的基本步驟。技術的基本步驟。二、教學重點、難點：二、教學重點、難點：基因工程的基本原理和基本操作步驟?；蚬こ痰幕驹砗突静僮鞑襟E。一、基因工程的原理和操作步驟：一、基因工程的原理和操作步驟： 原理：讓人們感興趣的基因（目的基因）在原理：讓人們感興趣的基因（目的基因）在宿主細胞中穩(wěn)定和高效表達。宿主細胞中穩(wěn)定和高效表達。 目的基因的獲??；目的基因的獲取； 形成重組形成重組DNA分子；分子； 重組重組DNA 導入受體細胞；導入受體細胞；

2、 篩選含有目的基因的受體細胞；篩選含有目的基因的受體細胞； 目的基因表達。目的基因表達。二、基因工程操作步驟：二、基因工程操作步驟：1.第一步：目的基因的獲取第一步：目的基因的獲?。?）方法：）方法： 從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因 利用聚合酶鏈式反應利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術擴增目的技術擴增目的基因基因（目的基因的序列已知）（目的基因的序列已知） 化學方法合成目的基因化學方法合成目的基因（目的基因的序列（目的基因的序列已知）已知） 從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因基因文庫?；蛭膸?。 利用利用PCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因 聚合酶鏈式反應，在生

3、物體外復制特定聚合酶鏈式反應，在生物體外復制特定DNADNA片段的核酸合成技術?？梢垣@得大量的目的基片段的核酸合成技術?？梢垣@得大量的目的基因。因。循環(huán)循環(huán)變性變性退火退火延伸延伸目的基因目的基因的擴增呈的擴增呈指數(shù)指數(shù)形式形式擴增（擴增（2n）化學方法合成目的基因化學方法合成目的基因化學方法合成目的基因化學方法合成目的基因2 2、形成重組形成重組DNA分子分子 核心核心質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種一個切口一個切口兩個粘性末端兩個粘性末端3 3、將

4、重組、將重組DNADNA導入受體細胞導入受體細胞轉化轉化 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。酵母菌和動植物細胞等。借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。（1 1）將重組）將重組DNADNA導入植物細胞導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法農(nóng)桿菌轉化法基因槍法基因槍法（2 2）將重組）將重組DNADNA導入動物細胞導入動物細胞顯微注射技術顯微注射技術提純基因表達載體提純基因表達載體體外顯微注射入受精卵體外顯微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植1.1.將重組將重組DNADNA導入植物細胞導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法農(nóng)桿菌轉化法基因槍法基因槍

5、法2.2.將重組將重組DNADNA導入動物細胞導入動物細胞顯微注射技術顯微注射技術（最多、最有效）（最多、最有效）3.3.將重組將重組DNADNA導入微生物細胞導入微生物細胞Ca2+處理，處理，以增加細菌細胞壁的通透性。以增加細菌細胞壁的通透性。抗氨芐青霉素基因抗氨芐青霉素基因點為目的基因與點為目的基因與質(zhì)粒質(zhì)粒A的結合點的結合點目前把重組質(zhì)粒導入細菌細胞時，效率還不高，導入完目前把重組質(zhì)粒導入細菌細胞時，效率還不高，導入完成后得到的細菌，實際上有的根本沒有導入質(zhì)粒，有的導入成后得到的細菌，實際上有的根本沒有導入質(zhì)粒，有的導入的是普通質(zhì)粒的是普通質(zhì)粒A A，只有少數(shù)導入的是重組質(zhì)粒。，只有少數(shù)

6、導入的是重組質(zhì)粒。四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因怎樣篩選出已經(jīng)導入質(zhì)粒的細胞？怎樣篩選出已經(jīng)導入質(zhì)粒的細胞？4.篩選含有目的基因的受體細胞篩選含有目的基因的受體細胞抗氨芐青霉素基因抗氨芐青霉素基因點為目的基因與點為目的基因與質(zhì)粒質(zhì)粒A的結合點的結合點四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因在此基礎上，怎樣鑒別已導入重組質(zhì)粒的細胞？在此基礎上，怎樣鑒別已導入重組質(zhì)粒的細胞？抗氨芐青霉素基因抗氨芐青霉素基因點為目的基因與點為目的基因與質(zhì)粒質(zhì)粒A的結合點的結合點四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因圖圖a a示基因工程中經(jīng)常選用的載體示基因工程中經(jīng)常選用的載體pBR322pBR322質(zhì)粒，質(zhì)粒，AmpAmpr r表示氨芐青

7、霉素抗表示氨芐青霉素抗性基因，性基因，TetTetr r表示四環(huán)素抗性基因。目的表示四環(huán)素抗性基因。目的基因如果插入基因如果插入四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性基因中，將使該基因中，將使該基因失活，而不再具有相應的抗性。基因失活，而不再具有相應的抗性。abAmprTetrc再將滅菌絨布按到圖再將滅菌絨布按到圖b的培養(yǎng)基上，的培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布平使絨布面沾上菌落，然后將絨布平移按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，移按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖得到如圖c的結果（空圈表示與的結果（空圈表示與b對對照無菌落的位置）。照無菌落的位置）。 為了檢查載體是否導入原本沒有為了檢查載體是否導入原本沒有A

8、mpr 和和Tetr的大腸桿菌，將大的大腸桿菌，將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，得到如圖養(yǎng)基上，得到如圖b的結果（黑的結果（黑點表示菌落）。點表示菌落）。原理：質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因原理：質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因方法：利用方法：利用選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基篩選篩選檢測轉基因生物的染色體檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入上是否插入了目的基因（關鍵）了目的基因（關鍵）檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（表達）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（表達）（2）常用的技術：）常用的技術：DNA分子雜交技術分子雜交技術蛋白質(zhì)

9、分子（抗原抗體）間的雜交蛋白質(zhì)分子（抗原抗體）間的雜交5. 目的基因的表達目的基因的表達（1）內(nèi)容：）內(nèi)容：分子水平：分子水平：DNA分子雜交技術分子雜交技術核心核心DNA探針探針目的基因的脫氧核苷目的基因的脫氧核苷酸（單鏈）序列片段酸（單鏈）序列片段用熒光分子用熒光分子或或放射性放射性同位素標記同位素標記看能否形看能否形成雜合的成雜合的雙鏈區(qū)雙鏈區(qū)檢測檢測鑒定鑒定檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNAmRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒

10、定等抗蟲鑒定、抗病鑒定等過程過程:A.首先取出轉基因生物的基因組首先取出轉基因生物的基因組DNAB.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段片段( 單鏈單鏈)用放射性同位素等作標記用放射性同位素等作標記,以此做探針以此做探針C.使探針和轉基因生物的基因組雜交使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體表明目的基因已插入染色體DNA中中方法方法: : DNADNA分子雜交分子雜交方法方法: : 分分 子子 雜雜 交交方法方法: : 抗原抗體雜交抗原抗體雜交過程過程:用上述探針和轉基因生物的用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜若出現(xiàn)雜交帶交帶,

11、表明目的基因轉錄出了表明目的基因轉錄出了mRNA.基因工程的基本操作程序目的基因的獲取目的基因的獲取形成重組形成重組DNADNA分子分子將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胧荏w細胞篩選含有目的基因的受體細胞和目的基因表達篩選含有目的基因的受體細胞和目的基因表達1、從基因文庫中獲取目的基因、從基因文庫中獲取目的基因2、利用、利用PCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因3、化學方法人工合成、化學方法人工合成農(nóng)桿菌轉化法、顯微注射法、農(nóng)桿菌轉化法、顯微注射法、CaCa2+2+處理法處理法DNADNA分子雜交技術、抗原分子雜交技術、抗原抗體雜交技術抗體雜交技術分子檢測外的個體水平鑒定分子檢測外的個體水平

12、鑒定本節(jié)小結：1. 用基因工程技術可使大腸桿菌合成人的蛋用基因工程技術可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是白質(zhì)。下列敘述不正確的是 A.常用相同的限制性內(nèi)切酶處理目的基因和常用相同的限制性內(nèi)切酶處理目的基因和質(zhì)粒質(zhì)粒 B.DNA連接酶和連接酶和 RNA聚合酶是構建重組質(zhì)聚合酶是構建重組質(zhì)粒必需的工具酶粒必需的工具酶 C.可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導入了重組質(zhì)粒否導入了重組質(zhì)粒 D.導入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表導入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達達 B鞏固練習鞏固練習2下列屬于獲取目的基因的方法的是下列屬于獲取目的基因的方法的是

13、( )利用利用mRNA反轉錄形成反轉錄形成 從基因文庫中提取從基因文庫中提取從受體細胞中提取從受體細胞中提取 利用利用PCR技術技術 利用利用DNA轉錄轉錄 人工合成人工合成A B CDD3.基因工程又叫基因拼接技術?；蚬こ逃纸谢蚱唇蛹夹g。 (1)在該技術中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之在該技術中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之一是：以目的基因轉錄的一是：以目的基因轉錄的 為模板，為模板， 成互成互補的單鏈補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成，然后在酶的作用下合成 。 (2)基因工程中常用的受體細胞有細菌、真菌、基因工程中常用的受體細胞有細菌、真菌、 。 (3)假設以大腸桿菌質(zhì)粒

14、作為載體，并以同一種限制性內(nèi)假設以大腸桿菌質(zhì)粒作為載體，并以同一種限制性內(nèi)切酶切割載體與目的基因，將切割后的載體與目的基因切酶切割載體與目的基因，將切割后的載體與目的基因片段混合，并加入片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有連接酶。連接產(chǎn)物至少有 種環(huán)狀種環(huán)狀DNA分子，它們分別分子，它們分別 是是 。信使信使RNA 逆轉錄逆轉錄 雙鏈雙鏈DNA(目的基因目的基因)動植物細胞動植物細胞 3 載體自連的、目的基因片段自連的、載體自連的、目的基因片段自連的、載體與目的基因片段相連的環(huán)狀載體與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子分子 目的基因與質(zhì)粒的連接目的基因與質(zhì)粒的連接 基因基因DNADNA文

15、庫的構建文庫的構建 將總將總DNADNA經(jīng)過酶解，分離不同長短的經(jīng)過酶解，分離不同長短的DNADNA片段。包片段。包含的基因片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上，感染含的基因片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上，感染細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構成了該生物的基細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構成了該生物的基因文庫。因文庫。DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術手段，將兩種生物的采用一定的技術手段，將兩種生物的DNADNA分子的單分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙那么，互補的

16、堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。的單鏈。 基因探針（基因探針（DNA探針）與目的基因雜交，有無探針）與目的基因雜交，有無雜交帶雜交帶 傳統(tǒng)的遺傳育種方法有哪些？ 傳統(tǒng)的遺傳育種方法能否解決不同種生物優(yōu)良性狀的重組問題？ 基因工程技術如何解決不同種生物優(yōu)良性狀的重組問題？基因工程的應用基因工程的應用基因工程的應用基因工程的應用一、基因工程與作物育種一、基因工程與作物育種二、基因工程與疾病治療二、基因工程與疾病治療（）基因工程藥物（）基因工程藥物（2 2）基因診斷）基因診斷（3 3）基因治療）基因

17、治療三、三、 基因工程與環(huán)境保護基因工程與環(huán)境保護基因工程的應用基因工程的應用一、基因工程與作物育種一、基因工程與作物育種1.抗蟲轉基因植物抗蟲轉基因植物2.抗病轉基因植物抗病轉基因植物3.其他抗逆轉基因植物其他抗逆轉基因植物（如抗鹽、抗旱、抗除草劑植物等）（如抗鹽、抗旱、抗除草劑植物等）4.利用轉基因改良植物的品質(zhì)利用轉基因改良植物的品質(zhì)基因工程在農(nóng)業(yè)上的應用：基因工程在農(nóng)業(yè)上的應用：1 1）高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具優(yōu)良品質(zhì)的品種）高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具優(yōu)良品質(zhì)的品種2 2）抗逆性品種）抗逆性品種基因工程與疾病治療基因工程與疾病治療v 基因工程藥品的生產(chǎn)基因工程胰島素基因工程胰島素 胰島素是治療糖尿病的胰島素

18、是治療糖尿病的特效藥，長期以來只能特效藥，長期以來只能依靠從豬、牛等動物的依靠從豬、牛等動物的胰腺中提取，胰腺中提取，100Kg100Kg胰胰腺只能提取腺只能提取4-5g4-5g的胰島的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。之高可想而知?；蚬こ桃葝u素基因工程胰島素 將合成的胰島素基因?qū)⒑铣傻囊葝u素基因?qū)氪竽c桿菌，每入大腸桿菌，每2000L2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g100g胰胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生島素！大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問題金還貴的藥品產(chǎn)量問題，還使其價格降低了，還使其價格降低了30%-50%!30%-50%!基因工程干擾素基因工程干擾素 干擾素治療病毒感染簡直是干擾素治療病毒感染簡直是“萬能靈藥萬能靈藥”！過去從人血中提取，過去從人血中提取，300L300L血才提取血才提取1mg1mg！其其“珍貴珍貴”程度自不用多說。程度自不用多說。SCID的基因工程治療的基因工程治療 重癥聯(lián)合免疫缺陷（重癥聯(lián)合免