細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1細(xì)胞因子細(xì)胞因子（cytokine, CK）指由免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）合成與分泌的，具有多種生物功能的小分子蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。因能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理功能而得名。可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫應(yīng)答和組織修復(fù)等。細(xì)胞因子一、細(xì)胞因子概述一、細(xì)胞因子概述第1頁(yè)/共32頁(yè)以生物學(xué)作用進(jìn)行劃分的分類以生物學(xué)作用進(jìn)行劃分的分類白細(xì)胞介素（Interleukin） IL-1、IL-2、 IL-18干擾素（Interferon） IFN-、IFN-、IFN-腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor） TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（C

2、olony-stimulating factor） M-CSF、G-CSF轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor） TGF- 趨化因子（Chemokine） IL-8、GROs、MCP-1生長(zhǎng)因子（Growth factor） EGF、FGF、IGF、PDGF第2頁(yè)/共32頁(yè) 細(xì)胞因子間的相互作用細(xì)胞因子間的相互作用IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、 GM-CSFTNF TGF IL-1 IFNIL-1 IFNTNFIL-1 TGFIFNIL2 IL-4IFN IL2 IL-4 IL-5 IL-6TNF IFN IL-1 TGFTNF IL-1 IFN IL-

3、5 GM-CSF G-CSF M-GSFTNFTNF IL-1 TGFIL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IL-1 IL-6IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IFN內(nèi)皮細(xì)胞成纖維細(xì)胞TB第3頁(yè)/共32頁(yè) 二、二、 細(xì)胞因子檢測(cè)的方法與原理細(xì)胞因子檢測(cè)的方法與原理（一）細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)（二）免疫學(xué)檢測(cè)（三）分子生物學(xué)檢測(cè)第4頁(yè)/共32頁(yè)1、細(xì)胞增殖或增殖抑制試驗(yàn)2、細(xì)胞毒活性測(cè)定3、抗病毒活性測(cè)定法4、細(xì)胞趨化活性測(cè)定法（一）細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)（一）細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)第5頁(yè)/共32頁(yè)第6頁(yè)/共32頁(yè) 通過檢測(cè)細(xì)胞通過檢測(cè)細(xì)胞DNADNA合成的增加或減少來(lái)判斷細(xì)

4、胞增殖的方合成的增加或減少來(lái)判斷細(xì)胞增殖的方法。在細(xì)胞的增殖過程中，法。在細(xì)胞的增殖過程中，DNADNA合成的增加使得指示細(xì)胞對(duì)核合成的增加使得指示細(xì)胞對(duì)核苷或堿基的需求增多，若將核苷標(biāo)記上可以示蹤的同位素（苷或堿基的需求增多，若將核苷標(biāo)記上可以示蹤的同位素（3 3H/H/125125I I ），通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的同位素含量，則可反映細(xì)胞增），通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的同位素含量，則可反映細(xì)胞增殖的程度。殖的程度。結(jié)果客觀易于自動(dòng)化結(jié)果客觀易于自動(dòng)化；適用于大標(biāo)本量的；適用于大標(biāo)本量的測(cè)定測(cè)定 方法的特異性受依賴方法的特異性受依賴細(xì)胞株影響；放射性細(xì)胞株影響；放射性污染污染(1) (1) 放射性核素?fù)饺敕?/p>

5、放射性核素?fù)饺敕ǖ?頁(yè)/共32頁(yè)特點(diǎn)：不使用放射性核素，特點(diǎn)：不使用放射性核素， 以細(xì)胞代謝變化為增殖指征以細(xì)胞代謝變化為增殖指征 指示細(xì)胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關(guān)指示細(xì)胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關(guān) 測(cè)定步驟類測(cè)定步驟類似似與同位素?fù)饺敕ㄏ啾扰c同位素?fù)饺敕ㄏ啾葥饺胛铮簱饺胛铮篗TTMTT而非而非3 3H-TdRH-TdR；反應(yīng)條件：選用的細(xì)胞及其濃度反應(yīng)條件：選用的細(xì)胞及其濃度、 培養(yǎng)時(shí)間不同培養(yǎng)時(shí)間不同(2) MTT (2) MTT 比色法比色法第8頁(yè)/共32頁(yè)本法常用于本法常用于TNF等的測(cè)定等的測(cè)定第9頁(yè)/共32頁(yè)Wish、Hep2/c 人干擾素人干擾素L929 小鼠干擾素小鼠

6、干擾素Ratec 大鼠干擾素大鼠干擾素A549MDBK 多種族的多種族的IFN-和和IFN-本法常用于本法常用于IFNIFN等的測(cè)定，等的測(cè)定，IFNIFN可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抑可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抑制病毒制病毒RNARNA和和DNADNA合成的酶，保護(hù)細(xì)胞不受病毒感染，合成的酶，保護(hù)細(xì)胞不受病毒感染，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（CPECPE）。）。 VSV、EMCV及及Sindbis virus等等細(xì)胞病變效應(yīng)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量3 3、抗病毒活性測(cè)定法、抗病毒活性測(cè)定法常用于檢測(cè)抗病毒活性的細(xì)胞株常用于檢測(cè)抗病毒活性的細(xì)胞株常

7、用于攻擊細(xì)胞的病毒常用于攻擊細(xì)胞的病毒檢測(cè)抗病毒活性的方法檢測(cè)抗病毒活性的方法第10頁(yè)/共32頁(yè)趨化性趨化性(chemotaxis)(chemotaxis)： 誘導(dǎo)細(xì)胞向由誘導(dǎo)細(xì)胞向由趨化因子低濃度處向趨化因子低濃度處向趨化因子高濃度處趨化因子高濃度處作定向移動(dòng)的特性作定向移動(dòng)的特性, ,可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗(yàn)可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗(yàn)?；瘜W(xué)增活性化學(xué)增活性(chemokinesis)(chemokinesis)： 細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力的特性細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力的特性, ,可采用可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)。瓊脂糖小滴化學(xué)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)。趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞移

8、動(dòng)的方式趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)的方式4 4、趨化活性測(cè)定法、趨化活性測(cè)定法第11頁(yè)/共32頁(yè)濾膜：計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞趨化因子細(xì)胞趨化試驗(yàn)原理示意趨化試驗(yàn)原理示意第12頁(yè)/共32頁(yè)靶細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)靶細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)1、對(duì)所測(cè)的細(xì)胞因子有特異的敏感性2、易培養(yǎng)、保存、生物學(xué)特性穩(wěn)定3、有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)4、種屬適配第13頁(yè)/共32頁(yè)各類細(xì)胞因子檢測(cè)的常用靶細(xì)胞各類細(xì)胞因子檢測(cè)的常用靶細(xì)胞細(xì)胞因子 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 干擾因素IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）

9、增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPOIL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4第14頁(yè)/共32頁(yè)各類細(xì)胞因子檢測(cè)的常用靶細(xì)胞各類細(xì)胞因子檢測(cè)的常用靶細(xì)胞細(xì)胞因子 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 干擾因素IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性粒細(xì)胞（M、H）趨化法GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5TNF/ L929 （M、H）細(xì)胞毒法IFN wish（H）病變保護(hù)法 IFN- 、 IFN- L929（M）病變保護(hù)法 IFN- 、 I

10、FN- 第15頁(yè)/共32頁(yè)敏感性較高敏感性較高特異性不高特異性不高操作繁瑣操作繁瑣易受干擾易受干擾生物學(xué)活性測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)生物學(xué)活性測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)第16頁(yè)/共32頁(yè)（二）免疫學(xué)檢測(cè)（二）免疫學(xué)檢測(cè)細(xì)胞因子(或受體)與相應(yīng)的特異性抗體( 單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合，通過同位素、熒光或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示， 從而定性或定量顯示細(xì)胞因子(或受體)的水平。1、ELISA法2、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)3、流式細(xì)胞分析法第17頁(yè)/共32頁(yè)1 1、ELISAELISA方法方法ELISAELISA法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標(biāo)免疫分析技術(shù)，一法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標(biāo)免疫分析技術(shù)，一步或多步的抗原抗體反應(yīng)和一

11、步酶促反應(yīng)構(gòu)成步或多步的抗原抗體反應(yīng)和一步酶促反應(yīng)構(gòu)成ELISAELISA的基的基本步驟，可作定性或定量分析。本步驟，可作定性或定量分析。ELISAELISA法不僅可以用于細(xì)法不僅可以用于細(xì)胞因子檢測(cè)，也可用于可溶性細(xì)胞因子受體或可溶性粘胞因子檢測(cè)，也可用于可溶性細(xì)胞因子受體或可溶性粘附因子的測(cè)定附因子的測(cè)定 第18頁(yè)/共32頁(yè)敏感性偏低敏感性偏低不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。ELISAELISA特異、簡(jiǎn)便特異、簡(jiǎn)便易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)可同時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處可同時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處理理細(xì)胞因子測(cè)定的首選方法細(xì)胞因子

12、測(cè)定的首選方法第19頁(yè)/共32頁(yè)2 2、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT(ELISPOT或或ElisaSpot) ElisaSpot) 在包被有待測(cè)細(xì)胞因子抗體的微孔板上，在包被有待測(cè)細(xì)胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測(cè)細(xì)胞，經(jīng)在有加入可分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測(cè)細(xì)胞，經(jīng)在有或無(wú)刺激物存在的條件下培養(yǎng)，待測(cè)細(xì)胞分泌或無(wú)刺激物存在的條件下培養(yǎng)，待測(cè)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子于其周圍，并被板上的特異性抗體捕細(xì)胞因子于其周圍，并被板上的特異性抗體捕獲。后續(xù)的反應(yīng)如同獲。后續(xù)的反應(yīng)如同ELISAELISA，即在洗去細(xì)胞后視，即在洗去細(xì)胞后視用于試驗(yàn)的酶標(biāo)抗體為一抗或二抗，分別作直用

13、于試驗(yàn)的酶標(biāo)抗體為一抗或二抗，分別作直接或間接法。接或間接法。 一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，斑一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，斑點(diǎn)的顏色深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子點(diǎn)的顏色深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量相關(guān)量相關(guān) 基基本本原原理理第20頁(yè)/共32頁(yè)ELISPOT第21頁(yè)/共32頁(yè)3 3、流式細(xì)胞分析法、流式細(xì)胞分析法 流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面粘附分子的檢測(cè)，通過特異性的熒光抗體染色，能簡(jiǎn)

14、單、快胞表面粘附分子的檢測(cè)，通過特異性的熒光抗體染色，能簡(jiǎn)單、快速地進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測(cè)，精確判斷不速地進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測(cè)，精確判斷不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)情況。同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)情況。 1 1分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞 2 2細(xì)胞固定細(xì)胞固定 3 3封閉非特異性結(jié)合位封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn) 4 4染色與分析染色與分析 基本步驟基本步驟第22頁(yè)/共32頁(yè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)激活膜抗原標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記第23頁(yè)/共32頁(yè)使用流式細(xì)胞分析法，可以：使用流式細(xì)胞分析法，可以：區(qū)分不同分泌特性的

15、細(xì)胞亞群：區(qū)分不同分泌特性的細(xì)胞亞群： Th1Th1細(xì)胞細(xì)胞 IFN-IFN- Th2 Th2細(xì)胞細(xì)胞 IL-4IL-4細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體：細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體： 單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù) 直接或間接熒光抗體染色直接或間接熒光抗體染色 無(wú)需作細(xì)胞固定和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉無(wú)需作細(xì)胞固定和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉 待測(cè)細(xì)胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細(xì)胞，保持良好待測(cè)細(xì)胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細(xì)胞，保持良好狀態(tài)狀態(tài)第24頁(yè)/共32頁(yè)免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 特異性高特異性高 操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需依賴細(xì)胞株操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需依賴細(xì)胞株 影響因素較少

16、且易控制，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化影響因素較少且易控制，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 所測(cè)定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物活性不所測(cè)定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定呈正比一定呈正比 結(jié)果與所用的抗體來(lái)源及親和力有很大的關(guān)系結(jié)果與所用的抗體來(lái)源及親和力有很大的關(guān)系 敏感性相對(duì)較低敏感性相對(duì)較低 標(biāo)本中細(xì)胞因子的可溶性受體，會(huì)影響特異性抗體對(duì)標(biāo)本中細(xì)胞因子的可溶性受體，會(huì)影響特異性抗體對(duì)細(xì)胞因子的結(jié)合細(xì)胞因子的結(jié)合第25頁(yè)/共32頁(yè)（三）分子生物學(xué)檢測(cè)（三）分子生物學(xué)檢測(cè) 此方法測(cè)定的并非細(xì)胞因子本身，而是此方法測(cè)定的并非細(xì)胞因子本身，而是細(xì)胞因子的基因。細(xì)胞因子的基因。方法：方法： 1、Northern印跡雜交法印跡雜交法 2、Southern 印跡雜交法印跡雜交法 3、PCR與逆轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄PCR 4、原位雜交，原位、原位雜交，原位PCR和原位和原位RTPCR 第26頁(yè)/共32頁(yè) 三、常用細(xì)胞因子的檢測(cè)方法三、常用細(xì)胞因子的檢測(cè)方法IL-2的檢測(cè)IFN-的檢測(cè)TNF的檢測(cè)第27頁(yè)/共32頁(yè)待檢樣品（細(xì)胞上清） 指示細(xì)胞（CTLL-2）按不同稀釋度加入37C，16-20小時(shí)加入3H