茯苓質(zhì)量評(píng)價(jià) 余生蘭

1、第6章 茯苓質(zhì)量評(píng)價(jià)第1節(jié) 概述 近年來(lái)，中藥以其獨(dú)特而顯著的療效越來(lái)越受到世界各國(guó)的青睞和重視1，但是由于中藥材所含化學(xué)成分的復(fù)雜性、技術(shù)條件、研究思路和方法等因素的局限2,使得中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)成為制約中藥現(xiàn)代化與產(chǎn)業(yè)化的主要障礙3。為了保證中藥在臨床上用藥安全、合理、有效，我們必須將中藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)在中藥研究、生產(chǎn)及臨床應(yīng)運(yùn)過(guò)程中貫徹和落實(shí)。 茯苓來(lái)源于多孔菌科Poria cocos (schw.)Wolf的干燥菌核，又名茯兔、茯靈、松薯、松苓等，首次記載于神農(nóng)本草經(jīng)，并列為上品。茯苓味甘、淡、性平；歸心、肺、脾、腎經(jīng)；具有利水滲濕、健脾安神等療效。在臨床常用于水腫尿少、痰飲眩悸、脾虛食少、心神

2、不安、便溏泄瀉、驚悸失眠等病癥的治療。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)茯苓具有抗腫瘤，鎮(zhèn)靜、免疫調(diào)節(jié)、利尿和保肝等方面的活性，已越來(lái)越引起人們的青睞和關(guān)注。我國(guó)茯苓主產(chǎn)于湖北、安徽（習(xí)稱“安苓”）、云南（習(xí)稱“云苓”）等地。長(zhǎng)期以來(lái)，茯苓藥材主要來(lái)自人工栽培。不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)期的茯苓中各種化學(xué)成分的有很大差異，其藥理作用也存在顯著差別。由于茯苓藥材在中醫(yī)臨床及人民生活中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，所以其質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要性不言而喻。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者在其化學(xué)、藥理及臨床應(yīng)用方面頗有成就。茯苓的商品質(zhì)量評(píng)價(jià)方面文獻(xiàn)記載多采用基源鑒別、性狀、顯微鑒別、理化鑒別、薄層色譜鑒別、高效液相色譜等方法進(jìn)行正偽品的鑒別并對(duì)其進(jìn)行品

3、質(zhì)評(píng)定。2015年中國(guó)藥典記載了性狀鑒別、理化鑒別、有效成分的定性鑒別及含量測(cè)定方法。由此可見(jiàn)，茯苓的質(zhì)量評(píng)價(jià)已廣受人們的的關(guān)注和重視。綜上所述，本章節(jié)旨在對(duì)茯苓的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，以期保證茯苓用藥安全、合理和有效。第2節(jié) 茯苓質(zhì)量評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一種技術(shù)規(guī)定，主要針對(duì)藥品的質(zhì)量規(guī)格及其檢測(cè)方法，是藥品生產(chǎn)、使用、供應(yīng)、檢驗(yàn)和管理部門所必須共同遵守的法定依據(jù)，來(lái)確保用藥安全有效。而根據(jù)我國(guó)法定生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)藥典，其內(nèi)容主要包括:名稱、來(lái)源、性狀、鑒別、檢查、浸出物、含量測(cè)定、性味與歸經(jīng)、功能與主治、用法與用量、注意、貯藏等。 1、 化學(xué)成分1.多糖類茯苓藥材中茯苓多糖（Pac

4、hymose）為其主要活性成分，前人研究報(bào)道多糖含量占84.2%，其中硬朊占0.68%，纖維素含量為2.84%；另有報(bào)道，茯苓中-茯苓聚糖（-pachyman）為茯苓多糖中的主要成分，占干燥品93%4左右。2. 三萜類到目前為止，中外學(xué)者從茯苓干燥菌核、茯苓皮或菌株培養(yǎng)液中分離共得到35中四環(huán)三萜化合物，可分為三種類型5：羊毛甾-7,9（11）-二烯型三萜（lanosta-7,9-diene type triterpenes）、羊毛甾-8-烯型三萜（lanosta-8-ene type triterpenes）和3,4-開(kāi)環(huán)-羊毛甾烷三萜烯型（3,4-seco-lanostan-7,9-die

5、ne type triterpenes）。除此之外，學(xué)者王利亞等6研究發(fā)現(xiàn)，可以從茯苓乙醚萃取相中分離得到-香樹(shù)脂醇乙酸酯；李典鵬等研究發(fā)現(xiàn)，從云南茯苓皮中分離在經(jīng)13C-NMR，1H-NMR,MS確認(rèn)得到齊墩果酸7.3.脂肪酸中外學(xué)者從白茯苓中研究發(fā)現(xiàn)，白茯苓中含有的脂肪酸主要含有辛酸（caprylic acid）、十一酸（undecanoic acid）、月桂酸（lauric acid）、十二酸（dodecanoic acid）、棕櫚酸（palmitic acid）8 。4.其它成分學(xué)者鄭虎占9研究發(fā)現(xiàn)，茯苓中除了含有多糖、三萜和脂肪酸類成分，還含有麥角甾醇，樹(shù)膠，甲殼質(zhì)，蛋白質(zhì)，脂肪，甾

6、醇，卵凝脂，右旋葡萄糖，腺嘌呤，組氨酸，膽堿，無(wú)機(jī)成分SiO2，Mg，P,Fe，Ca，S，Na，K，Mn，Cl，此外還含有-茯苓聚糖酶，以及微量蛋白酶；江成萍等10通過(guò)茯苓多糖中微量及常量元素的分析，發(fā)現(xiàn)Ca，Mg，Co，F(xiàn)e，Zn，P等營(yíng)養(yǎng)元素比其它保健品中高，同時(shí)還含有抗癌癥對(duì)硒元素及人體必需微量元素Sr、Mn、Cr、Co、Cu、V等，一些非必需的和重金屬元素As、Pb、Cd，均未檢出，醫(yī)療所用微量元素Al含量較高。2、 性狀11茯苓個(gè)：采挖于7月至8月間，藥材除去泥沙后，經(jīng)“發(fā)汗”，攤開(kāi)晾干至表面被干燥，“發(fā)汗”后的茯苓藥材再經(jīng)反復(fù)幾次晾曬至表面出現(xiàn)皺縮，藥材內(nèi)部的濕氣在背陰處干燥后，稱

7、作為“茯苓個(gè)”。呈類球形、橢圓形、扁圓形或不規(guī)則團(tuán)狀，大小不一。表皮薄且粗糙，呈棕褐色至黑褐色，有明顯的皺縮紋理。茯苓皮為菌核的外表皮；赤茯苓為近外表皮淡紅色的部分；白茯苓為中間白色部分；茯神為中間抱有松根部分。茯苓體重，質(zhì)堅(jiān)實(shí)，斷面呈顆粒性，有的具有裂隙。氣微，味淡，嚼之黏牙。茯苓塊：呈立方塊狀或立方塊狀厚片，大小不一。為去皮后切制的茯苓,顏色多為為白色、淡棕色或淡紅色。茯苓片：呈不規(guī)則厚片，厚薄不一。為去皮后切制的茯苓，顏色多為為白色、淡棕色或淡紅色。三、鑒別1.理化鑒別藥典12鑒別：常通過(guò)觀察茯苓粉末灰白色，不規(guī)則顆粒狀團(tuán)塊及分枝狀團(tuán)塊，無(wú)色，遇水合氯醛液漸溶化。菌絲無(wú)色或淡棕色，細(xì)長(zhǎng)，

8、稍彎曲，有分枝，直徑3-8m，少數(shù)至16m。藥典12鑒別：取粉末1g，加丙酮10mL，水浴中邊加熱邊振搖，加熱10分鐘，濾過(guò)。濾液蒸干，殘?jiān)?mL冰醋酸溶解，再加濃硫酸1滴，顯淡紅色，后變淡褐色。藥典12鑒別：取本品片或粉末少許，加碘化鉀碘試液1滴，顯深紅色。楊啟德13報(bào)導(dǎo)通過(guò)采用茯苓中茯苓酸和麥角甾醇的李伯曼反應(yīng)（冰醋酸-濃硫酸反應(yīng)）來(lái)鑒別茯苓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液由淡紅色變?yōu)榘稻G色。閻文玫14通過(guò)測(cè)定茯苓中活性成分在200-320nm的紫外吸收情況，來(lái)對(duì)茯苓的正偽品進(jìn)行鑒別。2.薄層鑒別 藥典鑒別12：取本品粉末1g，加乙醚50mL，超聲處理10分鐘，放冷；過(guò)濾，揮干溶劑；殘?jiān)蛹状?mL使溶

9、解，作為供試品溶液。另取茯苓對(duì)照藥材1g同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法中國(guó)藥典（2015年版四部通則0502）實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液各2L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:5:0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴灑2%香草醛硫酸-乙醇溶液（4:1）混合溶液，在105使顯色完全。供試溶液薄層色譜中，在與對(duì)照品溶液薄層色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)。 肖培根等人15采用薄層色譜法，以 0.5%CMC 硅膠 G板為吸附劑，石油醚-醋酸乙酯(1:1)為展開(kāi)劑，4%磷鉬酸乙醇溶液 100加熱顯色，以麥角甾醇、-谷甾醇為對(duì)照品來(lái)鑒別。結(jié)果顯示供試溶液在與對(duì)照品溶液薄層色譜

10、相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色斑點(diǎn)。四、含量測(cè)定1. 茯苓多糖含量測(cè)定照分光光度法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0401）測(cè)定13。 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg，置于100mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度線，即得0.1g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，放置于4條件下保存。供試品溶液的制備 精密稱取過(guò)60目篩的茯苓樣品粉末1.0于具塞錐形瓶中，加入50純水，超聲30min后用0.45微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液10mL定容至50mL容量瓶，即得供試品溶液。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0于10mL試管中，補(bǔ)加純水

11、至1mL，再加入5苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min。取出后,補(bǔ)足減失體積，在490nm處測(cè)定其吸光度。 測(cè)定法取茯苓樣品，配制供試品溶液。分別精密移取各供試品溶液0.5mL，加純水至1mL加入5苯酚溶液1mL，濃硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min。取出后，補(bǔ)足減失體積，在490nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同仿野生栽培茯苓樣品中茯苓多糖的百分含量。本品含多糖不得少于0.418%。苯酚-硫酸法測(cè)定茯苓中多糖的含量16 茯苓多糖的提取與精制 取茯苓粉末11.59g，經(jīng)120mL石油醚（60-90）于索氏器中加熱回流四小時(shí)，消除單糖及低聚糖。將藥渣

12、放入2000mL燒杯中。加入1000mL16mol/L尿素溶液，再與70下攪拌24小時(shí)，濾去殘?jiān)?，濾液經(jīng)減壓濃縮至250mL，加750mL甲醇，析出對(duì)沉淀依次用甲醇，乙醚和丙酮洗滌三次，最后干燥，即得無(wú)定形粉末狀的茯苓多糖。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取新蒸餾得到的苯酚（182下的餾分）8g，然后加入蒸餾水120mL，置于棕色瓶中，充分混合即得苯酚試液。精稱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100.0mg于105下干燥至恒重，置于100mL容量瓶中，后加入蒸餾水制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取0,10,20,40,60,80,100uL于具刻度比色管中，各加蒸餾水至體積為2.0mL，再各加苯酚試液1.0mL，搖勻，迅速滴

13、加濃硫酸5.0mL，搖勻后再靜置5min，最后沸水浴25min，取出放冷至室溫，用空白對(duì)照管校零，再于490nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得回歸方程為A=6.788X×10-3C+1.551×10-3，r=0.9986。 換算因子的確定精稱 茯苓多糖50.0mg，加蒸餾水溶解，并定容至100mL得到貯備液。精密吸取貯備液200uL（內(nèi)含多糖W=100ug）按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)的方法測(cè)定其吸光度，并由線性回歸方程求出相應(yīng)的葡萄糖的含量C,最后按照f(shuō)=W/C，測(cè)得換算因子為3.25。 樣品溶液的制備 精稱茯苓樣品粉末1.000g，用濾

14、紙包好，用80%乙醇100mL于索氏器中加熱回流提取四小時(shí)，獲得的殘?jiān)D(zhuǎn)移至潔凈對(duì)燒杯中，加50mL6mol/L的尿素溶液，80下攪拌5h，減壓過(guò)濾得到殘?jiān)?，殘?jiān)媚蛩厝芤阂劳ㄌ幚砣危喜V液，最后用蒸餾水稀釋，并定容至1000mL。 測(cè)定法精密吸取樣品溶液100uL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下測(cè)定吸光度，再由線性回歸方程求出樣品中葡萄糖含量C，最后由公式：多糖含量（%）=f·c/G，其中f為換算因子，G為相同體積的樣品溶液對(duì)應(yīng)的茯苓質(zhì)量。本品含多糖大于80%。2. 茯苓三萜的含量測(cè)定茯苓總?cè)频暮繙y(cè)定13 照分光光度法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0401）測(cè)定。顯色條件5%香草醛

15、-冰醋酸0.4mL、高氯酸1.8mL為顯色劑，70水浴恒溫20min。 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取茯苓酸對(duì)照品14.8mg，置于50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。 供試品溶液的制備 稱取茯苓藥材粉末(40目)約2g，精密稱定，置100mL具塞三角瓶中，加入甲醇30mL，冷浸30分鐘，超聲提取90分鐘(用甲醇補(bǔ)足失重)，濾過(guò)，減壓回收溶劑；殘?jiān)?0mL水捏溶，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，減壓蒸干；殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液200L，600L和供試品溶液300L，分別置具塞試管

16、中，水浴揮去溶劑，冷卻，準(zhǔn)確加入0.4mL5香草醛-冰醋酸溶液和1.8mL高氯酸，混勻，密塞。置 70恒溫水浴中加熱 20min，取出，冷卻至室溫，加冰醋酸5mL，搖勻，以試劑為空白，在540nm處測(cè)定吸光度。 本品含總?cè)祁惓煞郑ㄒ攒蜍咚嵊?jì)）的含量不得少于0.3%。茯苓酸的含量測(cè)定 照高效液相色譜法中國(guó)藥典(2015年版四部通則0512）測(cè)定。 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水-乙酸（700 : 300 : 為流動(dòng)相）；檢測(cè)器波長(zhǎng) 210nm。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取取茯苓酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制成每1mL含 0.76mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別取2、4、6、8

17、、10L注入高效液相色譜儀。以進(jìn)樣量和峰面積進(jìn)行回歸，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。 供試品溶液的制備 取茯苓粉末（40目）約2g，精密稱定，置100m L具塞錐形瓶中，加入甲醇30mL，超聲處理90分鐘(中途補(bǔ)充損失的甲醇)，取出，放冷，過(guò)濾，濾液減壓蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；用微孔濾膜（0.45m）濾過(guò)，即得。 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液5L，10L和供試品溶液20L，注入高效液相色譜儀。測(cè)定，即得。 本品含茯苓酸不得少于 0.035%茯苓皮中總?cè)频暮繙y(cè)定 按照董紅敬的分光光度法測(cè)定17。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充

18、劑；乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)540nm。 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取1.12mg齊墩果酸置于10mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，再用甲醇定容，搖勻，備用。 供試品溶液的制備：分別精密稱取茯苓皮95%乙醇提取物和乙酸乙酯提取物26.72mg和25.26mg置于錐形瓶中，精密移取20mL甲醇，超聲15min使樣品溶解。待冷卻至室溫后，作為母液；再分別取1mL母液于10mL量瓶中，定容，備用。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別置于具塞試管中，水浴揮干溶劑，冷卻至室溫，精密加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4mL和1.8mL高氯酸

19、溶液，搖勻，密塞，置于70恒溫水浴鍋中加熱20min，取出并冷卻至室溫，再加5mL冰醋酸，搖勻后，在540nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸的質(zhì)量（g）為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測(cè)定法：分別精密移取1mL兩種供試品溶液定容于10mL容量瓶中，從中取出1mL，測(cè)定其吸光度。將所得吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可計(jì)算含量。 本品按干燥品計(jì)算，95%乙醇提取物中三萜含量不得少于43.5%，乙酸乙酯提取物中三萜含量不得少于50.3%。 去氫茯苓酸和茯苓酸含量的同時(shí)測(cè)定 照高效液相色譜法測(cè)定18。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%磷酸溶液（75:25）為流動(dòng)相

20、；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。理論塔板數(shù)按茯苓酸峰計(jì)算不低于3000。 對(duì)照品溶液的制備：精密稱定適量的茯苓酸和去氫茯苓酸對(duì)照品于同一10mL量瓶中，加氯仿-甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到混合對(duì)照品溶液。精密移取該混合溶液1.0mL置10mL量瓶中，用甲醇稀釋，配制成去氫茯苓酸和茯苓酸分別均含0.1g·L-1 對(duì)照溶液。 供試品溶液的制備：取本品粉末約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10mL甲醇，超聲處理（功率250W，頻率為33KHZ）30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干。殘?jiān)铀芙?，乙酸乙酯萃?次，每次10mL，合并乙酸乙酯層，蒸干，殘?jiān)眉状既芙舛ㄈ葜?0mL量瓶中，搖勻，濾過(guò)即

21、可。 測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10L,注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。 本品按干燥品計(jì)算，含去氫茯苓酸（C33H50O4）不得少于2.13%，茯苓酸（C33H52O5）不得少于3.155。去氫土莫酸、豬苓酸C、3-差向去氫土莫酸和去氫茯苓酸含量的同時(shí)測(cè)定 按照沈玉萍等人的反相高效液相色譜法測(cè)定19。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以乙腈-0.05%磷酸水溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)243nm。 對(duì)照品溶液的制備：分別取7.17mg去氫土莫酸、2.21mg豬苓酸C、5.12mg3-差向去氫土莫酸和12.35mg去氫茯苓酸，精密稱定后置于25的容量

22、瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。以二倍稀釋法制得6份混合對(duì)照品溶液，待測(cè)。 供試品溶液的制備：取本品粉末（過(guò)50目篩）1.00g，精密稱定，加入50mL具塞錐形瓶中，精密加入20ml甲醇后，精密稱重，超聲30分鐘（功率250W，頻率50kHz），冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液，備用。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取6份混合對(duì)照品溶液20L進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，混合對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（µg·mL-1）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程。 測(cè)定法：精密移取供試品溶液20L進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，代入線性方程，即可計(jì)算出百分含量（%）

23、。 去氫土莫酸、土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸含量的同時(shí)測(cè)定 按照張靚琦等人摸索的超高液相色譜法測(cè)定20。 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn):以十八烷基鍵合硅烷為填充劑；乙腈-0.05%（梯度洗脫）的磷酸水溶液為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。 對(duì)照品溶液的制備：取對(duì)照品約4mg土莫酸、10mg豬苓酸C、10mg去氫茯苓酸，精密稱定，分別置于10mL容量瓶中；取對(duì)照品5mg去氫土莫酸、2mg3-表去氫土莫酸和5mg茯苓酸，精密稱定，分別置于5mLml容量瓶中；各對(duì)照品用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液，備用。分別吸取適量各對(duì)照品溶液于同10mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，

24、即得去氫土莫酸、土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、去氫茯苓酸和茯苓酸的質(zhì)量濃度分別為0.1080,0.0408，0.1004,0.0424,0.1012和0.1020mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。 供試品溶液的制備：取本品粉末約0.5mg（過(guò)60號(hào)目篩，40干燥12h），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）30分鐘，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，用0.22m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密移取0.25,0.5，1.0，2.0和3.8混合對(duì)照品溶液分別置于5mL容量瓶中

25、，加甲醇稀釋并定容，搖勻。第6點(diǎn)即用混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣20L，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（g·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測(cè)定法：精密移取供試品溶液20L進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出去氫土莫酸等6種三萜酸的百分含量（%）。 茯苓皮中松苓新酸的含量測(cè)定按照閆雪生等人摸索的高效液相色譜條件測(cè)定21。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以乙腈-0.5%磷酸水溶液（80:20）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)242nm。對(duì)照品溶液的制備：精密稱取2.28mg松苓新酸對(duì)照品于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成228g·mL-1的松苓新酸對(duì)照品

26、溶液，備用。供試品溶液的制備：約取1.0g茯苓皮粗粉，精密加入50ml甲醇，稱定質(zhì)量后加熱回流，冷卻，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。初濾液棄去，精密量取2mL續(xù)濾液，蒸干溶劑轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，備用。測(cè)定法：精密移取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10L進(jìn)樣，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算茯苓皮中松苓新酸的含量。 去氫土莫酸的含量測(cè)定 照高效液相色譜法測(cè)定22,-23。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-四氫呋喃-5%醋酸（65:3:32）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)242nm。理論塔板數(shù)不得低于3000。

27、 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取適量的去氫土莫酸對(duì)照品，置于10mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即可得濃度為0.04mg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。 供試品溶液的制備：取本品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約2g，精密稱定后置于50mL錐形瓶中，精密移取20mL甲醇，密塞，浸泡1h，超聲處理40min后，取出。冷卻至室溫，濾過(guò)，初濾液棄去，取續(xù)濾液作為供試品溶液。 測(cè)定法:分別精密移取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10L進(jìn)樣，用外標(biāo)法以峰面積17計(jì)算樣品中去氫土莫酸的含量。 本品按干燥品計(jì)算，含去氫土莫酸（C31H50O4）不得少于0.0096%。 豬苓酸C和去氫土莫酸的含量測(cè)定 按照金曉勇等人摸索

28、的高效液相色譜條件測(cè)定24。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以乙腈-水-磷酸（70:29.85:0.15）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)244nm。 對(duì)照品溶液的制備：精密稱定4.48mg豬苓酸C，3.43mg去氫土莫酸對(duì)照品分別置于兩個(gè)10mL的容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，得到0.448mg·mL-1豬苓酸C和0.343mg·mL-1去氫土莫酸對(duì)照品溶液，備用。精密移取豬苓酸C、去氫土莫酸對(duì)照品溶液1ml至同一10ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液，備用。 供試品溶液的制備：取0.4g本品粉末（過(guò)60目篩）,精密稱定，加入20m

29、L甲醇-0.5%乙酸溶液，超聲提取30min，稱定質(zhì)量后用提取液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，減壓蒸干，殘?jiān)靡译嫒芙?，定容?mL容量瓶中，用微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。 測(cè)定法：精密移取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20L進(jìn)樣，用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算豬苓酸C和去氫土莫酸的含量。3. 茯苓超高效液相色譜特征指紋圖譜按照張琦等人摸索的超高效液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定25標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取3-酮基-6-羥基土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、3-（4-羥基苯甲酰氧基）-土莫酸、去氫茯苓酸、3-羥基苯甲酰氧基-土莫酸適量，先精密稱定，加甲醇溶解，制成含有3-酮基-6-羥基土莫酸0.03g&#

30、183;L-1、去氫土莫酸0.1g·L-1、豬苓酸C0.1g·L-1、3-表去氫土莫酸0.04g·L-1、3-（4-羥基苯甲酰氧基）-土莫酸0.004g·L-1、去氫茯苓酸0.1g·L-1、3-羥基苯甲酰氧基-土莫酸0.004g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，最后經(jīng)過(guò)0.22m微孔濾膜濾過(guò)，于低溫下冷藏下備用。供試品溶液的配制精密稱取茯苓藥材粉末約0.5g，后經(jīng)十萬(wàn)分之一天平精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移取甲醇10mL，稱定，超聲（選用功率為250w，頻率為33kHZ）30min，放置冷卻，最后用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過(guò)0.22m微孔濾膜濾過(guò)，

31、取續(xù)濾液作為供試品溶液。 測(cè)定法 取15批不同產(chǎn)地的樣品，按上述方法配制供試品溶液，然后按上述已確定對(duì)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果共獲得20個(gè)色譜峰，并最終確認(rèn)其中7個(gè)共有峰，分別為3-酮基-6-羥基土莫酸（5號(hào)峰）、去氫土莫酸（10號(hào)峰）、豬苓酸C（13號(hào)峰）、3-表去氫土莫酸（14號(hào)峰）、3-（4-羥基苯甲酰氧基）-土莫酸（16號(hào)峰）、去氫茯苓酸（17號(hào)峰）、3-羥基苯甲酰氧基-土莫酸（18號(hào)峰）。4.茯苓中重金屬的含量測(cè)定13 照電感耦合等離子體質(zhì)譜法（中國(guó)藥典2015年版四部通則0412）測(cè)定。4.1供試品溶液的制備精密稱取樣品粉末0.1g，分別置于聚四氟乙烯消解罐中，加入6mL

32、優(yōu)級(jí)純硝酸浸泡樣品1h，再加入3mL氫氟酸和2mL30%過(guò)氧化氫，封罐，置于微波消解儀內(nèi)進(jìn)行消解。消解程序結(jié)束后，待罐內(nèi)溫度稍降，將消解罐取出置于微機(jī)控溫加熱板上120進(jìn)行趕酸，待酸揮發(fā)至約1mL時(shí)取下稍冷，將消解液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶?jī)?nèi)，用1%硝酸少量多次潤(rùn)洗消解罐內(nèi)壁，再用1%硝酸溶液定容，將定容好的母液轉(zhuǎn)移至15mLEP管內(nèi)，置于4保存?zhèn)溆?。同法制備?duì)應(yīng)的空白對(duì)照溶液。4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將Cu、As、Pb、Cd標(biāo)準(zhǔn)品溶液用1%硝酸溶液按梯度稀釋為濃度0.1，0.2，1， 2，5，10，20，50g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液，按此法稀釋內(nèi)標(biāo)元素（5g·L-1），測(cè)定得到校

33、準(zhǔn)曲線。4.3測(cè)定法將供試品溶液按適當(dāng)倍數(shù)進(jìn)行稀釋，通過(guò)ICP-MS法進(jìn)行測(cè)定。藥典規(guī)定中藥材中，鉛不得超過(guò)105mg·kg-1、鎘不得超過(guò)15mg·kg-1、砷不得超過(guò)55mg·kg-1。5. 茯苓中微量元素含量的測(cè)定王德淑等人26利用PEA100原子吸收光譜儀測(cè)定茯苓中微量元素的含量：樣品制備：采用切片曬干的塊狀茯苓樣品，首先在烘箱中于100左右烘2h，接著在瑪瑙研缽中磨碎，最后過(guò)100目篩，裝瓶備用。樣品消解：精密稱定2.000g左右以上制備的樣品置于一只潔凈干燥的200mL燒杯中，先加入濃硝酸10mL，接著用少量去離子水沖洗杯壁，蓋上表面皿，靜置于第二天早

34、上，在電熱上低溫加熱至干，接著補(bǔ)加5mL濃硝酸、1mL濃高氯酸和5mL左右的去離子水，繼續(xù)加熱，直至溶液開(kāi)始產(chǎn)生高氯酸白煙，此時(shí)應(yīng)當(dāng)取下表面皿，同時(shí)加熱趕凈高氯酸。最后用1%的硝酸定容至10mL，待測(cè)。同時(shí)做全程序空白，并用國(guó)家環(huán)境監(jiān)測(cè)總站的標(biāo)樣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量控制。測(cè)定法：茯苓藥材中鉀的含量最高，高達(dá)8005mg·kg-1；鈉、鐵、鎂的含量都在1005mg·kg-1附近；銅、錳含量在105mg·kg-1；鋅、鉻含量在1-25mg·kg-1范圍內(nèi)；鈷和鎳的含量均低于1-25mg·kg-1.季懷萍等人利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法27同時(shí)測(cè)定

35、茯苓藥材中多種微量元素： 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 將Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Zn標(biāo)準(zhǔn)品溶液用1%硝酸溶液依次按梯度稀釋為濃度0，5，50，100；0，0.1，1，2；0,1,10,20；0，5，50，100；0,1,10,20；0,1,10,20的g·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液，并進(jìn)行測(cè)定得到校準(zhǔn)曲線。供試品溶液的制備將處理好的茯苓樣品于80的條件下烘干，粉碎。研磨，混勻后放入稱量瓶中備用。精密稱定上述制備的茯苓粉末樣品0.1000g置于四氯乙烯坩堝中，接著各加入5.0mL硝酸和0.5mL高氯酸，蓋上坩堝蓋浸泡過(guò)夜。消解前先將坩堝蓋取下，將坩堝置于可控恒溫電熱板，加熱至120消化溶解。待試

36、樣溶解完全呈透明液體時(shí)，加壓濃縮至體積為1.0mL取下，冷卻后將試液轉(zhuǎn)入10.0mL的容量瓶中，并用去離子水定容至刻度，即得。 測(cè)定法 將供試品溶液按適當(dāng)倍數(shù)進(jìn)行稀釋，通過(guò)ICP-AES法進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示茯苓藥材中鉀點(diǎn)含量高達(dá)832g·mL-1；鈉、鎂、鐵的含量均在100g·mL-1左右；鈣的含量約在90g·mL-1；銅和錳的含量為10g·mL-1左右；鋅、鉻在1-2g·mL-1之間；鈷和鎳的含量均低于1g·mL-1。李弈等人利用火焰原子吸收光譜法28測(cè)定茯苓藥材中微量元素： 供試品溶液的制備 首先將烘干的天然茯苓和液體發(fā)酵的茯

37、苓分別放入粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)篩后放入烘箱中，于60下烘干至恒重，最后裝入具塞瓶中，貼上標(biāo)簽，放入干燥器內(nèi)備用。精密稱定粉碎干燥的天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓個(gè)1g于消解罐中，先加入10mL濃硝酸和2mL過(guò)氧化氫，浸泡30min，接著于微波爐中密閉消解29，消解完成后，自然冷卻后取出開(kāi)罐，將消解液置于電熱上趕凈殘酸，接著轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，最后去離子水定容至刻度待測(cè)。同時(shí)做空白試液。按照火焰原子吸收光譜法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 將K、Ca、Mn、Mg、Cu、Fe、Cr、Zn、Pb、Cd的標(biāo)準(zhǔn)品溶液用1%硝酸溶液依次按梯度稀釋為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，按照火焰原子吸收光譜法測(cè)定，依次得到線性方程：

38、A=0.1311C+0.2537（r=0.9993）；A=0.0541C+0.0122（r=0.9985）；A=0.3495C+0.0038（r=0.9992）；A=0.0454C+0.0042（r=0.9987）；A=0.2355C+0.0012（r=0.9991）；A=0.0673C+0.0057（r=0.9997）；A=0.0326C0.0012（r=0.9978）；A=2510C+0.0002（r=0.9982）；A=01364C+0.1253（r=0.9976）；A=0.1436C0.0003（r=0.9996）。測(cè)定法 將供試品溶液按適當(dāng)倍數(shù)進(jìn)行稀釋，通過(guò)火焰原子吸收光譜法進(jìn)行測(cè)定

39、并根據(jù)上述線性回歸方程計(jì)算得出茯苓中微量元素的含量。 天然茯苓和液體發(fā)酵茯苓中：鉀的含量分別為664.2g·g-1和572.6g·g-1；鉻對(duì)含量均為0.02g·g-1；鉛含量分別為0.6g·g-1和0.5g·g-1。茯苓中鉛和鉻含量均符合我國(guó)藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（Pb 5mg·kg-1；Cd0.35mg·kg-1）。四、檢查1.水分 按照中華人民共和國(guó)藥典（2015年版，一部）通則0832第二法測(cè)定，不得超過(guò)18.0%。2.總灰分 按照中華人民共和國(guó)藥典（2015年版，一部）通則2302測(cè)定，不得超不得過(guò)2.0

40、%.五、浸出物 按照中華人民共和國(guó)藥典（2015年版，一部）醇溶性浸出物測(cè)定法（通則2201）項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，溶劑用稀乙醇，不得少于2.5%。參考文獻(xiàn)1 劉靜,周曉梅,祝與鳴,等. 中藥質(zhì)量控制方法研究進(jìn)展J.中國(guó)藥房,2010,21(3):281-282.2 肖小河,金城,趙中振,等.論中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)模式的創(chuàng)新與發(fā)展J. 中國(guó)中藥雜志,2007,34(14):1377-1381.3 陶燕蓉,陳曦.中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀與分析J. 中藥與臨床2011,2(2):59-62.4 喻宗源.茯苓研究進(jìn)展.湖北化工.1991,(1):10-18.5 仲兆鑫,劉浚.茯苓有效成分三萜的研究進(jìn)展.中成藥,2001,23(1):58-62.6 王利亞,萬(wàn)惠杰,陳