天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程

1、ICS?點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)點(diǎn)擊此處添加中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)DB62甘 肅 省 地 方 標(biāo)DB62/XXXX) XXXX隴南市天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程點(diǎn)擊此處添加標(biāo)準(zhǔn)英文譯名點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)2014-XX-XX 實(shí)施2014-XX-XX 發(fā)布甘肅省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局?發(fā)布前?言III1 范圍12 規(guī)范性引用文件 13 術(shù)語(yǔ)和定義13.1 萌發(fā)菌13.2 蜜環(huán)菌13.3 菌材13.4 母種13.5 原種13.6 栽培種14 萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌的培養(yǎng) 24.1 培養(yǎng)條件24.2 菌種培養(yǎng)24.2.1 萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌一級(jí)菌種（母種）培養(yǎng) 2PDA培養(yǎng)基制備2菌種選擇 2分離方法2菌

2、種純化34.2.2 萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌二級(jí)菌種（原種）培養(yǎng) 3萌發(fā)菌二級(jí)菌種培養(yǎng) 3蜜環(huán)菌二級(jí)菌種培養(yǎng) 34.2.3 萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌三級(jí)菌種（栽培種）培養(yǎng) 3萌發(fā)菌三級(jí)菌種培養(yǎng) 3蜜環(huán)菌三級(jí)菌種培養(yǎng) 34.2.4 菌種保藏 3一級(jí)菌種保藏 3二級(jí)菌種和三級(jí)菌種保藏 34.3 蜜環(huán)菌枝培養(yǎng) 44.3.1 樹(shù)種選擇44.3.2 培養(yǎng)時(shí)間44.3.3 培養(yǎng)方法44.4 蜜環(huán)菌材培養(yǎng) 44.4.1 菌種準(zhǔn)備44.4.2 樹(shù)種選擇44.4.3 培養(yǎng)時(shí)間44.4.4 木材準(zhǔn)備 44.4.5 場(chǎng)地選擇44.4.6 培養(yǎng)方法44.4.7 培養(yǎng)管理5調(diào)節(jié)濕度 5調(diào)節(jié)溫度 55 菌種質(zhì)量55.1 母種質(zhì)量55.1.1

3、 直接觀察55.1.2 顯微鏡檢查 55.1.3 觀測(cè)菌絲長(zhǎng)速 55.1.4 耐高溫測(cè)試 55.1.5 吃料能力鑒定 55.2 栽培種質(zhì)量55.2.1 質(zhì)量指標(biāo)55.2.2 驗(yàn)收規(guī)則66 標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯藏 66.1 標(biāo)志66.2 包裝66.3 運(yùn)輸66.4 貯藏6前？?言本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1 2009給出的規(guī)則編制。本標(biāo)準(zhǔn)由隴南市農(nóng)牧局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：隴南市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、甘肅省中草藥資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王義存、喬旭、張杰、楊廣孝、楊正文、尹玉保、武建華隴南市天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了隴南市天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌培養(yǎng)技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義

4、、萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌菌種的培養(yǎng)。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于隴南市天麻主產(chǎn)區(qū)及其它同類氣候環(huán)境區(qū)域天麻萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌固體菌種的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB191包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB9687食品包裝用聚乙烯成型品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB9688食品包裝用聚丙烯成型品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)NY5099無(wú)公害食品食用菌栽培基質(zhì)安全技術(shù)要求3術(shù)語(yǔ)和定義3.1 萌發(fā)菌天麻(Gastrodiaelata BI.)種子的萌發(fā)靠小菇屬(Mycena) 類真菌菌絲侵染種胚

5、提供營(yíng)養(yǎng)而萌發(fā)， 這類促進(jìn)天麻種子萌發(fā)的真菌稱為天麻種子萌發(fā)菌。主要包括：紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、石斛小菇(Mycenadendrobii)、蘭小菇(Mycenaorchicola )禾口開(kāi)唇小菇(Mycenaanoectochila)。3.2 蜜環(huán)菌蜜環(huán)菌(Armillariamellea )是擔(dān)子菌綱傘菌目真菌，天麻種子萌發(fā)后，其所需營(yíng)養(yǎng)逐漸由蜜環(huán)菌供 給，是天麻不可缺少的互惠共生菌。3.3 菌材生有蜜環(huán)菌或萌發(fā)菌的木棒、樹(shù)枝、樹(shù)葉統(tǒng)稱為菌材。菌材是培養(yǎng)天麻所必備的材料，包含：菌棒：指生長(zhǎng)有蜜環(huán)菌的木棒。菌棒采用直徑410cm的木棒，主要用于培養(yǎng)天麻。菌枝：指生長(zhǎng)有

6、蜜環(huán)菌的樹(shù)枝。菌枝采用直徑23cm的樹(shù)枝，是培養(yǎng)天麻的補(bǔ)充材料。菌葉：指生長(zhǎng)有萌發(fā)菌的樹(shù)葉。菌葉是萌發(fā)菌三級(jí)種的主要組成。3.4 母種從菌索、子實(shí)體、著生菌絲體的天麻塊莖，經(jīng)各種方法分離得到的純菌絲體培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物，以玻璃試管為培養(yǎng)容器和單位，也稱一級(jí)種、試管種。3.5 原種由母種移植、擴(kuò)大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。常以菌種瓶或聚丙烯塑料袋為容器，也稱二級(jí)種。3.6 栽培種由原種移植、擴(kuò)大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。常以塑料袋為容器。栽培種只能用于栽培，不可再次擴(kuò)大繁殖菌種。4 萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌的培養(yǎng)4.1 培養(yǎng)條件 萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌的培養(yǎng)必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，需要有接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)

7、、接種工具；菌種培養(yǎng)室、恒溫培養(yǎng)箱、菌種培養(yǎng)架；高壓蒸氣滅菌鍋、電熱干燥箱，紫外滅菌燈；菌種保藏用電冰 箱；化學(xué)藥品，試管、天平等。菌種和基質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合NY5099勺規(guī)定和要求。使用水源符合GB5749的要求。4.2 菌種培養(yǎng)4.2.1 萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌一級(jí)菌種（母種）培養(yǎng)421.1 PDA培養(yǎng)基制備PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯 200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml、pH56。配制方法：將馬鈴薯切片，加水煮沸30min，用紗布過(guò)濾，取濾液1000ml并放入瓊脂加熱，使之全部融化，最后加入葡萄糖，溶解后調(diào)節(jié)pH為56。然后將培養(yǎng)基趁熱分裝于試管內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌（1.5kg/cm 2

8、） 30min。取出后按25°斜度放置冷卻后接種。消毒滅菌：接種室滅菌每立方米用 40%的甲醛溶液8ml，高錳酸鉀5g進(jìn)行熏蒸。先關(guān)閉窗戶，取甲醛 溶液裝入容器中，再放入高錳酸鉀，人隨之離開(kāi)接種室，關(guān)閉房門，熏蒸1h即可。熏蒸后應(yīng)隔1d使用。4.2.1.2 菌種選擇使用正規(guī)菌種廠生產(chǎn)勺優(yōu)良品種； 或采收天麻種子發(fā)芽后勺原球莖、 蘭科植物中勺根部、 誘導(dǎo)培養(yǎng) 萌發(fā)菌子實(shí)體。用以上材料分離培養(yǎng)菌種。4.2.1.3 分離方法4.2.1.3.1 組織分離萌發(fā)菌分離： 將天麻種子萌發(fā)勺原球莖用自來(lái)水沖洗干凈， 然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次， 置于滅過(guò)菌勺 小培養(yǎng)皿中，原球莖用0.1 %氯化汞溶液浸泡消

9、毒12min，用滅菌小剪刀剪成23段，在金霉素液中蘸 一下，即可接人PDA平面培養(yǎng)基中，置于25C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，310d即可發(fā)出菌絲。蜜環(huán)菌分離：將蜜環(huán)菌索或天麻塊莖，或天麻原球莖，或蘭科植物勺根分別用水洗凈表面泥土，然后切取需要的部份組織，用無(wú)菌水沖洗3次，放入0.1%氯化汞溶液浸泡1min；再用無(wú)菌水沖洗3次，洗去殘存的藥液，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)?；?qū)⒕鞯炔牧戏謩e剪成1cm長(zhǎng)的小段或小塊，在青霉素液（20卩g/ml ） 中浸片刻，用滅菌濾紙吸去表面附著水液，然后接種于斜面培養(yǎng)基上，置25C恒溫培養(yǎng)，37天左右，開(kāi)始分別長(zhǎng)出白色菌絲和菌索。分離子實(shí)體時(shí)，用無(wú)菌水沖洗消毒殘存藥液后，用滅菌濾紙吸

10、凈水珠， 再用解剖刀從菌蓋中縱向剖開(kāi)子實(shí)體，在菌柄及菌蓋交界處取其0.5cm的一塊組織置于PDAt養(yǎng)基上培養(yǎng)。4.2.1.3.2 孢子分離將開(kāi)傘的子實(shí)體截去菌柄的下半部，用70%的酒精在菌蓋表面及菌柄部分進(jìn)行揩擦消毒，然后菌褶向下插在孢子收集裝置的支架上。 將支架放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中， 用鐘罩或大燒杯罩住以收集孢子。 孢子落 于皿內(nèi)后，用接種針挑取少許，接于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。4.2.1.4 菌種純化萌發(fā)菌選用菌落生長(zhǎng)速度較為一致的菌絲體， 用消毒的接種鏟連同培養(yǎng)基一起切取菌絲， 轉(zhuǎn)移到新 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)轉(zhuǎn)接可獲純菌種。蜜環(huán)菌在培養(yǎng)基上接種點(diǎn)處剛產(chǎn)生菌索分枝時(shí)， 選擇其中生長(zhǎng)旺盛而幼嫩的菌索，

11、 用接種鏟截取長(zhǎng) 23mr移入斜面培養(yǎng)基上，在 25C恒溫下培養(yǎng)，菌索長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后即為純化的一級(jí)菌種。4.2.2 萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌二級(jí)菌種（原種）培養(yǎng)4.221萌發(fā)菌二級(jí)菌種培養(yǎng)培養(yǎng)基成分：青桐、樺木等馬葉珂対勺木屑70%麩皮或米糠26%蔗糖1%石膏粉1%磷酸二氫鉀1.5%、 硫酸鎂0.5%，加水適量。將以上成分充分拌勻，含水量 65%即用手捏培養(yǎng)基可略有滴水為度，然后裝 瓶，在瓶中心打直徑1cm的圓孔，深達(dá)培養(yǎng)基 2/3處。蓋好瓶蓋，高壓蒸氣滅菌(1.5kg/cm2) 1h,冷卻后接種。在接種室內(nèi)，將菌絲連同約蠶豆大小的母種，接于培養(yǎng)基的圓孔中，1支母種可接原種510瓶(袋)左右，蓋好瓶蓋后置

12、 25 C培養(yǎng)室培養(yǎng)。4.2.2.2 蜜環(huán)菌二級(jí)菌種培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為闊葉樹(shù)鋸木屑30%麥麩10%及小樹(shù)枝段，水適量。制作時(shí)，先將手指粗的樹(shù)枝截成長(zhǎng)1.5cm的小段，在水中浸泡12h充分吸水，然后與鋸木屑、麥麩拌勻、加水濕透，裝入500ml廣口瓶中，每瓶裝入樹(shù)枝段5060段，以瓶容量的4/5為宜，再加水少量，蓋瓶蓋后高壓滅菌( 1.5kg/cm 2) 1h,冷 卻后，接入母種，置于 25C恒溫培養(yǎng)，30天45天蜜環(huán)菌絲和菌索可長(zhǎng)滿全瓶。4.2.3 萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌三級(jí)菌種(栽培種)培養(yǎng)4.2.3.1 萌發(fā)菌三級(jí)菌種培養(yǎng)取殼斗科植物落葉70%木屑10%麥麩15%硫酸鎂0.5%，磷酸二氫鉀1.5%、尿

13、素1%蔗糖1%石 膏1%,水適量。經(jīng)拌勻后裝袋，高壓蒸氣滅菌(1.5kg/cm 2) 1h,冷卻后接入二級(jí)菌種，封好袋子，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)。4.2.3.2 蜜環(huán)菌三級(jí)菌種培養(yǎng)培養(yǎng)料和培養(yǎng)方法與二級(jí)菌種培養(yǎng)相同。在高壓滅菌冷卻后，每瓶接入二級(jí)樹(shù)枝菌種12段，在25C恒溫培養(yǎng)30d45d,蜜環(huán)菌絲和菌索可長(zhǎng)滿全瓶，可用于培養(yǎng)菌枝和菌材。4.2.4 菌種保藏4.2.4.1 一級(jí)菌種保藏當(dāng)一級(jí)菌種長(zhǎng)滿試管后，用牛皮紙包扎好，放入0C4C的冰箱中，每隔3個(gè)月轉(zhuǎn)管培養(yǎng)1次。使用時(shí)，應(yīng)從冰箱中取出先經(jīng)適應(yīng)常溫后再轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。包裝儲(chǔ)運(yùn)標(biāo)志符合GB191的要求。4.2.4.2 二級(jí)菌種和三級(jí)菌種保藏二、三級(jí)菌種可在

14、冷涼、干燥、清潔的室內(nèi)保藏，室溫在0C10C，保藏期23個(gè)月。4.3 蜜環(huán)菌枝培養(yǎng)4.3.1 樹(shù)種選擇用作菌材的樹(shù)木應(yīng)是闊葉落葉樹(shù)種。常用來(lái)培養(yǎng)菌材的樹(shù)種有：樺樹(shù)、野櫻桃、法國(guó)梧桐、桃樹(shù)、 青崗棟、板栗、水冬瓜、刺槐、槲棟、橡樹(shù)等，以甜、澀味、質(zhì)硬耐腐的樹(shù)種為宜。4.3.2 培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)根據(jù)需要，一般應(yīng)在菌材培養(yǎng)期之前2個(gè)月進(jìn)行。4.3.3 培養(yǎng)方法選擇直徑12cm的樹(shù)枝，斜砍成長(zhǎng)34cm的小段。其次，挖長(zhǎng)2米，寬1米，深30cm的坑；坑底先鋪 1cm厚濕潤(rùn)樹(shù)葉，然后擺一層樹(shù)枝，再放入菌種，在菌種上再擺一層樹(shù)枝，蓋一薄層沙土，以覆蓋填滿 樹(shù)枝間空隙為度?？梢来味逊?810層，蓋10cm厚沙土，再

15、蓋一層樹(shù)葉保溫保濕。一般2個(gè)月可培養(yǎng)好菌種。4.4 蜜環(huán)菌材培養(yǎng)441菌種準(zhǔn)備菌枝是培養(yǎng)菌材最好的菌種。選擇菌枝表面附著棕紅色、幼嫩、有白色生長(zhǎng)點(diǎn)、無(wú)雜菌污染的做菌種。也可用培養(yǎng)好的優(yōu)質(zhì)菌材作菌種。4.4.2 樹(shù)種選擇同 431。4.4.3 培養(yǎng)時(shí)間選擇在秋、冬季至春初培養(yǎng)菌材。4.4.4 木材準(zhǔn)備選直徑35cm的樹(shù)木，鋸成長(zhǎng)20cm的木段，若樹(shù)木直徑在10cm以上，應(yīng)將木段劈成24塊，在木段 的一面或兩面每隔34cm砍一個(gè)魚(yú)鱗口，深度至木質(zhì)部為度。4.4.5 場(chǎng)地選擇應(yīng)選擇在天麻種植場(chǎng)地附近，減少菌材搬運(yùn)；坡度應(yīng)小于20°和向陽(yáng)的山地，土壤以土層深度，疏松透氣，排水良好的砂壤土，要

16、有灌溉水源的地方為宜。4.4.6 培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法有多種，現(xiàn)以窖培法為例。挖窖長(zhǎng)2m,寬1米，深30cm。將窖底挖松整平，鋪一層1cm厚的樹(shù)葉，平放一層樹(shù)木段，如是干木段應(yīng)提前一天用水浸泡24h,在樹(shù)木段之間放入菌枝 45根，灑一些清水，澆濕樹(shù)木段和樹(shù)葉，然后用沙土或腐殖土填滿樹(shù)木段間空隙，并略高于樹(shù)木段為宜。再放入第二層樹(shù)木段，樹(shù)木段間放入菌枝后，如上法蓋一層土。如此依次放置多層，蓋土厚10cm成龜背狀略高于地面，最后覆蓋樹(shù)葉保溫保濕。4.4.7 培養(yǎng)管理4.4.7.1 調(diào)節(jié)濕度主要是保持菌材窖內(nèi)填充物及樹(shù)木段內(nèi)適宜的含水水量即50%左右。應(yīng)注意勤檢查，根據(jù)培養(yǎng)窖內(nèi)濕度變化進(jìn)行澆水和排水。4

17、.4.7.2 調(diào)節(jié)溫度蜜環(huán)菌索在6C28C可以生長(zhǎng)，超過(guò)30C生長(zhǎng)受抑制，同時(shí)雜菌易繁殖。在18C20C溫度條件適宜蜜環(huán)菌生長(zhǎng)。在春秋低溫季節(jié)，可覆蓋塑料薄膜提高窖內(nèi)溫度。培養(yǎng)窖上蓋枯枝落葉或草可以保溫 保濕。5菌種質(zhì)量5.1 母種質(zhì)量5.1.1 直接觀察對(duì)引進(jìn)的菌種，首先用肉眼觀察包裝是否合乎要求，棉塞有無(wú)松動(dòng)，試管、玻璃瓶或塑料袋有無(wú)破損，棉塞和管瓶或袋中有無(wú)雜菌和病蟲(chóng)侵染，菌絲色澤是否正常， 有無(wú)發(fā)生老化，受光面是否產(chǎn)生子實(shí)體，含水量是否標(biāo)準(zhǔn)等。5.1.2 顯微鏡檢查事先要準(zhǔn)各好顯微鏡、載玻片、吸管、鑷子、接種針、蒸餾水等物品在載坡片上放1滴蒸餾水，然后挑取少許菌絲置水滴上， 蓋好蓋玻片

18、， 再置顯微鏡下觀察玻片也可通過(guò)普通染色后進(jìn)行鏡檢。 菌絲透 明，呈分枝狀，有橫隔，鎖狀聯(lián)合明顯。5.1.3 觀測(cè)菌絲長(zhǎng)速將供測(cè)的菌種接入新配制的試管斜面培養(yǎng)基上， 置最適宜的溫、 濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 如果苗絲生 長(zhǎng)迅速，整齊濃密，健壯有力，別表明是優(yōu)良菌種：若菌絲生長(zhǎng)緩慢，或長(zhǎng)速特快，稀疏無(wú)力，參差不 齊，易于衰老，則表明是劣質(zhì)菌種。5.1.4 耐高溫測(cè)試將母種試管數(shù)支置于最適溫度下培養(yǎng)，一周后取出部分試管置32C培養(yǎng)，24h后再放回最適宜溫度下培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)這樣偏高的處理， 如果菌絲仍然健壯、旺盛生長(zhǎng)，則表明該品種具有耐較高溫度的優(yōu)良特 征：反之，菌絲生長(zhǎng)緩慢，且出現(xiàn)倒伏發(fā)黃、萎縮無(wú)力，則可認(rèn)為是不抗高溫菌種。5.1.5 吃料能力鑒定將菌種接入最佳配方的原種培養(yǎng)基中， 置最適宜的溫、 濕度條什下培養(yǎng)， 一周后觀察菌絲的生長(zhǎng)情 況。吃料萌發(fā)快，則說(shuō)明吃料能力強(qiáng)：反之，則表明該品種對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)能力差。5.2 栽培種質(zhì)量5.2.1 質(zhì)量指標(biāo)無(wú)害蟲(chóng)雜菌，上下一體，潔白一致，袋壁有少量水珠、無(wú)積水。 菌塊完整、不萎縮、不散碎、