分子生物學(xué)在醫(yī)藥中的研究進(jìn)展及應(yīng)用_第1頁
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文檔簡介

1、分子生物學(xué)在醫(yī)藥中的研究進(jìn)展及應(yīng)用 韓靜靜摘要分子生物學(xué)是對生物在分子層次上的研究。這是一門生物學(xué)和化學(xué)之間跨學(xué)科的研究,其研究領(lǐng)域涵蓋了遺傳學(xué)、生物化學(xué)和生物物理學(xué)等學(xué)科。分子生物學(xué)主要致力于對細(xì)胞中不同系統(tǒng)之間相互作用的理解,包括DNA,RNA和蛋白質(zhì)生物合成之間的關(guān)系以及了解它們之間的相互作用是如何被調(diào)控的。分子生物學(xué)主要研究遺傳物質(zhì)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)程中的分子基礎(chǔ)。分子生物學(xué)的中心法則認(rèn)為“DNA 制造 RNA,RNA 制造蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)反過來協(xié)助前兩項流程,并協(xié)助 DNA 自我復(fù)制”。分子生物技術(shù)也稱之為生物工程,是現(xiàn)代生物技術(shù)的主要標(biāo)志,它是以基因重組技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)為基礎(chǔ),利

2、用生物體或者生物組織、細(xì)胞及其組分的特性和功能,設(shè)計構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種或新品種以便與工程原理相結(jié)臺進(jìn)行生產(chǎn)加工為社會提供商品和服務(wù)的一個綜合性技術(shù)體系,其內(nèi)容包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、DNA測序技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、酶工程技術(shù)等?,F(xiàn)代分子生物技術(shù)的誕生以70年代DNA重組技術(shù)和淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用為標(biāo)志迄今已走過了30多年的發(fā)展歷程。實踐證明在解決人類面臨的糧食、健康、環(huán)境和能源等重大問題方面開辟了無限廣闊的前景。受到了各國政府和企業(yè)界的廣泛關(guān)注。是21世紀(jì)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)的先導(dǎo)。二十世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)發(fā)展的主要特點之一是對生命現(xiàn)象和疾病本質(zhì)的認(rèn)識逐漸向分子水平深入。DNA雙螺旋結(jié)

3、構(gòu)的發(fā)現(xiàn)為分子醫(yī)學(xué)和基因醫(yī)學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。人們逐漸認(rèn)識到,無論健康或疾病狀態(tài)都是生物分子及其相互作用的結(jié)果,生物分子中起關(guān)鍵性作用者為基因及其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì),因此從本質(zhì)上說,所有的疾病都可以被認(rèn)為是“基因病”。近十年來,分子生物技術(shù)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有力的研究工具,以下從基因工程技術(shù)、人類基因組計劃與核酸序列測定技術(shù)、基因診斷與基因體外擴(kuò)增技術(shù)、生物芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中為了解疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,診斷和藥物研制、開發(fā)中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞:分子生物學(xué) 分子生物技術(shù) 醫(yī)藥 基因芯片 蛋白質(zhì)組學(xué)第一章 文獻(xiàn)綜述31.1 分子生物學(xué)發(fā)展史31.2 分子生物學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)41.2.2 分于生物納米技術(shù)在基因診

4、斷中的應(yīng)用51.2.3 分子納米技術(shù)在基因療法中的應(yīng)用51.2.4 分子生物芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用51.3 藥學(xué)分子生物學(xué)51.4 分子生物學(xué)在中藥的研究61.4.1 中藥研究與基因組學(xué)61.4.2 DNA分子標(biāo)記技術(shù)與中藥新藥研發(fā)61.5 分子生物學(xué)在生藥學(xué)中的研究71.5.1 藥用動植物遺傳多樣性的分子檢測與分子系統(tǒng)學(xué)研究71.5.2 代謝途徑基因工程與中藥材品質(zhì)定向調(diào)控71.5.3 生藥分子藥理學(xué)形成與發(fā)展71.5.4 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與分子生藥學(xué)方法的創(chuàng)新7第二章 分子生物學(xué)在醫(yī)藥中的應(yīng)用82.1 分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用82.1.1 基因工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用82.1.2 基

5、因芯片技術(shù)82.1.3 分子生物學(xué)在檢驗醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用92.1.4 分子生物學(xué)技術(shù)在病理診斷及研究中的應(yīng)用92.1.5 蛋白質(zhì)芯片在病理中的應(yīng)用102.2分子生物學(xué)在藥學(xué)中的應(yīng)用102.2.1 基因芯片用于藥物篩選102.2.2 生物工程與生物制藥102.2.3蛋白質(zhì)組學(xué)在藥學(xué)研究中的應(yīng)用11第三章 應(yīng)用前景12參考文獻(xiàn)13第一章 文獻(xiàn)綜述1.1 分子生物學(xué)發(fā)展史第二次世界大戰(zhàn)之后25年,這個時期雖然可以用自然科學(xué)的許多領(lǐng)域的迅猛發(fā)展加以表征,但是發(fā)生了最深遠(yuǎn)的和革命性的進(jìn)展的是生物學(xué)領(lǐng)域。這些年里,分子研究和生物化學(xué)研究的成熟和一體化,達(dá)到了連本世紀(jì)頭幾十年里最空談理論的機(jī)械論者都可能期望的深

6、度和廣度。像胚胎學(xué)、遺傳學(xué)或進(jìn)化論那樣的以前在組織、細(xì)胞或群體水平上作了研究的領(lǐng)域,逐步地表明在特定的大分子的分子結(jié)構(gòu)方面具有共同的基礎(chǔ)。對于諸如蛋白質(zhì)和稍后的核酸分子的結(jié)構(gòu)和功能的研究,展示了探究生命系統(tǒng)微觀結(jié)構(gòu)的新前景,并且顯示了生物學(xué)廣闊的領(lǐng)域之間的新聯(lián)系,而生物學(xué)各個領(lǐng)域之間的共同基礎(chǔ),以前只是模糊地被人們推測過。當(dāng)本世紀(jì)四十年代至五十年代人們弄清了核酸是主要的遺傳物質(zhì)以及核酸通過指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成而發(fā)生作用的時候,有關(guān)遺傳的研究再次成為二十世紀(jì)生物學(xué)中的一個革命性的和占有主導(dǎo)地位的領(lǐng)域。摩爾根學(xué)派的工作已表明基因可以看作是有形的染色體的片段,但他們沒有試圖研究基因的分子性質(zhì)或任何有關(guān)基

7、因的生化功能。這個問題是確實存在的,但探討它卻是不成熟的和難以弄清的。因此,當(dāng)適合于探討細(xì)胞內(nèi)特定分子的相互作用的研究工具和技術(shù)變得有效時,遺傳學(xué)在二十世紀(jì)再次呈現(xiàn)出令人鼓舞的景象是不足為奇的。生物學(xué)現(xiàn)在的“分子生物學(xué)”不僅包括結(jié)構(gòu)和功能的要素,而且包括信息的要素。它關(guān)往生物學(xué)上的重要分子,比如蛋白質(zhì)或核酸的結(jié)構(gòu),從這些分子如何在細(xì)胞的新陳代謝中起作用以及它們?nèi)绾螖y帶特定的生物信息的方面關(guān)注這些分子的結(jié)構(gòu)問題。物理學(xué)和結(jié)構(gòu)化學(xué)的方法比如結(jié)晶分子的X射線衍射,分子模型的建立,已經(jīng)應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)的研究,同時生物化學(xué)也應(yīng)用于確定細(xì)胞內(nèi)部大分子如何彼此相互作用、大分子如何與小分子相互作用的問題。在歷史

8、上,有三方面思路通向我們今天所知道的分子生物學(xué)的形成:1.結(jié)構(gòu)方面與生物分子的結(jié)構(gòu)有關(guān),2. 生物化學(xué)方面:與生物分子如何在細(xì)胞新陳代謝和遺傳過程中相互作用的問題有關(guān),3.信息方面:與信息如何從一代有機(jī)體傳遞到下一代并且信息如何轉(zhuǎn)譯為獨(dú)特的生物分子的問題有關(guān)1。生物化學(xué)遺傳學(xué)細(xì)胞生物學(xué)生物物理學(xué)微生物學(xué)有機(jī)化學(xué)物理化學(xué) 相互滲透進(jìn)入細(xì)胞水平相互促進(jìn)20世紀(jì)中葉生物學(xué)引入生物大分子 分子生物學(xué) 圖一 分子生物學(xué)的發(fā)展過程在19世紀(jì)和20世紀(jì)隨著各個學(xué)科的發(fā)展,特別是生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物物理學(xué)、微生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)的發(fā)展,各個學(xué)科互相滲透,互相促進(jìn)荷香交融,而生物學(xué)的發(fā)展隨著

9、這些學(xué)科在生物學(xué)中的應(yīng)用已經(jīng)從物種、個體等層次上發(fā)展到細(xì)胞水平上,到了二十世紀(jì)中葉,隨著檢測儀器的快速發(fā)展,大分子如核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的鑒定,使得生物大分子引入到生物學(xué)中,隨后發(fā)展成分子生物學(xué),如圖一。二十一世紀(jì)是生物學(xué)的世紀(jì),同時生物學(xué)中的核心是分子生物學(xué),在現(xiàn)在分子生物學(xué)對整個社會及人類產(chǎn)生了重要的影響,分子生物學(xué)的核心就是通過生物的物質(zhì)基礎(chǔ)核酸、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的機(jī)構(gòu)、功能及其互相作用等運(yùn)動規(guī)律的研究來闡明生物分子基礎(chǔ),從而探討生命的奧秘,隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展,特別是物理、化學(xué)、儀器分析的發(fā)展使得分子生物學(xué)的發(fā)展在分子水平上取得了巨大的進(jìn)步,人類可以通過研究核酸、蛋白質(zhì)來闡述人類自身

10、發(fā)展的困難及在醫(yī)學(xué)中可以解釋很多疑難雜癥。分子生物學(xué)的發(fā)展更加借助了現(xiàn)代社會十分關(guān)鍵的工具計算機(jī),化學(xué)信息學(xué)通過計算機(jī)模擬確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),從而使研究者更加生動形象的了解蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,它已經(jīng)與其他學(xué)科結(jié)合,如生理學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等,尤其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ),而且發(fā)展了很多分支學(xué)科,例如分子細(xì)胞學(xué)、分子病毒學(xué)、分子診斷學(xué)、分子治療學(xué)、分子病理學(xué)、分子藥理學(xué)、生物制藥等。本論文將重點研究分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)及藥學(xué)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展。1.2 分子生物學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快的前沿領(lǐng)域,即是生命科學(xué)的領(lǐng)先學(xué)

11、科,而且是與其他學(xué)科廣泛交叉于滲透的重要前沿領(lǐng)域使得現(xiàn)代生命科學(xué)的內(nèi)涵和外延在不斷擴(kuò)大。二十一世紀(jì)醫(yī)學(xué)發(fā)展的主要特點之一是對生命現(xiàn)象和疾病本質(zhì)的認(rèn)識逐漸向分子水平深入。隨著基因克隆技術(shù)趨向成熟和基因涌序工作逐步完善,后基因時代逐步到來。人們逐漸認(rèn)識到無論健康或疾病狀態(tài)都是生物分子的相互作用的結(jié)果,生物分子起關(guān)鍵性作用。最近十年,分子生物技術(shù)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域極其有力的研究工具基因工程技術(shù)、人類基因組計劃與核酸序列測定技術(shù)、基目診斷與基因體外擴(kuò)增技術(shù)、生物芯片拄術(shù)、分子納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中如了解疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、疾病診斷和藥物研制與開發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。同時,在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和環(huán)境基因組

12、學(xué)逢勃發(fā)展的形勢下。分子生物醫(yī)學(xué)技術(shù)將會取得突破性進(jìn)展也給醫(yī)學(xué)帶來了嶄新的局面,為醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展提供新的機(jī)遇。分子生物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的前沿和熱點。分子生物學(xué)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中有很大的應(yīng)用,分子生物學(xué)在發(fā)病機(jī)制和藥學(xué)研究中的作用、分子生物學(xué)在疾病診斷中的作用、分子生物學(xué)在疾病治療中的作用、分子生物學(xué)在醫(yī)藥工業(yè)中的作用等這是現(xiàn)在科學(xué)家研究的熱點。下面簡要介紹幾種分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。12.1 分子生物傳感器在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用分子生物傳感器是利用一定的生物或化學(xué)固定技術(shù)將生物識別元件(如酶、抗體、抗原、蛋白、核酸、受體、細(xì)胞、微生物、動植物組織)固定在換能器上當(dāng)待測物與生物識別元件發(fā)生特異性反應(yīng)后,

13、通過換能器將所產(chǎn)生的反應(yīng)結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵?、檢測的電信號和光信號等,以此對待測物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析,從而達(dá)到檢測分析的目的。分子生物傳感器可以廣泛地應(yīng)用于對體藏中的散量蛋白、小分子有機(jī)物、核酸等多種物質(zhì)的檢測。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗中這些項目是臨床診斷和病情分折的重要依據(jù)。能夠在體肉實時監(jiān)控的生物傳感器對于手術(shù)中或重癥監(jiān)護(hù)的病人都程有幫助。1.2.2 分于生物納米技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用基因診斷是利用分子雜交及熒光技術(shù)檢測DNA片段,已經(jīng)為基因診斷在臨床上的應(yīng)用帶來了巨大的發(fā)展前景。研究表明,利用納米技術(shù)如利用金納米微粒結(jié)合雜交DNA片段,很容易進(jìn)人機(jī)體細(xì)胞核,并與核內(nèi)染色體組臺具有較高的特異性,可以

14、克服目前基因診斷所面臨的一些困難和問題。進(jìn)一步提高了基因診斷在實驗室中的地位??茖W(xué)家通過超順磁性氧化鐵納米粒脂質(zhì)體對肝癌的研究,提高了直徑3nm以下的腫瘤檢測率。結(jié)論表明,納米微粒對腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷具有重要意義。1.2.3分子納米技術(shù)在基因療法中的應(yīng)用基因治療是臨床治療學(xué)上的重大發(fā)展其基本原理是:質(zhì)粒DNA進(jìn)入目的細(xì)胞后,可以修復(fù)遺傳錯誤,或可產(chǎn)生治療因子,如多肽、蛋白質(zhì)、抗原等,納米技術(shù)能使DNA通過主動靶向作用定位于細(xì)胞。將質(zhì)粒DNA縮小到50200nm,帶上負(fù)電荷進(jìn)入到細(xì)胞核,插入到細(xì)胞核DNA的確切部位,起到對癥治療效果。同時分子納米技術(shù)能夠快速有救地確定基因序列、基因和藥物的體

15、內(nèi)走向、傳進(jìn)和定位傳遞使臨床診斷和治療過程效率得以提高。同時無機(jī)納米顆粒體積小,可在血管中隨血液循環(huán),通過血管璧進(jìn)入各個臟器的細(xì)施中,作為新型非病毒型基因載體能有效介導(dǎo)DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)并使其在細(xì)胞內(nèi)高水平的表達(dá),從而為基因表達(dá),功能研究及基因治療提供了新的技術(shù)和手段。1.2.4 分子生物芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及人們對疾病過程的認(rèn)識加鐸傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)已不能完全適應(yīng)微量、快速、準(zhǔn)確、全面的要求。所謂的生物芯片是指將大量探針分子固定于支持物上(通常支持物上的一個點代表一種分子探針)并與標(biāo)記的樣品雜交或反應(yīng),通過自動化儀器檢測雜交或反應(yīng)信號的強(qiáng)度而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。在檢測

16、病原苗方面由于大部分細(xì)菌、病毒的基因組測序已完成,將許多代表每種微生物的特殊基因制成1張芯片通過反轉(zhuǎn)錄可檢測標(biāo)本中的有無病原體基因的表達(dá)及表達(dá)的情況以判斷病人感染病原及感染的進(jìn)程、宿主的反應(yīng)。由于P53抑癌基因在多數(shù)腫瘤中均發(fā)生突變因此其實是重要的腫瘤診斷靶基因2。1.3 藥學(xué)分子生物學(xué)分子生物學(xué)與藥學(xué)的應(yīng)用主要是藥物基因組學(xué)、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)與現(xiàn)代藥物的結(jié)合,藥物基因組學(xué)是主要以闡明藥物代謝、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物靶分子的基因多態(tài)性與藥物作用包括療效和毒副作用之間關(guān)系的一門科學(xué),是一門新興的研究領(lǐng)域。通過研究基因多樣性,可以指導(dǎo)藥物設(shè)計、開發(fā)新藥及合理用藥。藥物蛋白質(zhì)組學(xué)是基因、蛋白質(zhì)、疾病三者項鏈的

17、橋梁科學(xué),主要的研究比藥物基因組學(xué)更復(fù)雜。分子生物學(xué)的新理論和新技術(shù) 滲入 藥學(xué)藥學(xué)研究領(lǐng)域 化學(xué) 誕生 藥學(xué)、化學(xué)藥學(xué)分子生物學(xué) 生命科學(xué) 圖二 藥學(xué)與分子生物學(xué)的關(guān)系在過去幾十年,藥物得到全面發(fā)展,現(xiàn)在市場上大部分藥物都是化學(xué)藥物,藥物的合成都是通過化學(xué)制藥,通過有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)合成出目標(biāo)產(chǎn)物,通過篩選,選出具有藥物活性的,但是藥物通過化學(xué)合成得到,所以會有毒副作用,現(xiàn)在通過引進(jìn)分子生物學(xué)應(yīng)用到藥學(xué)中,得到新的研究方向即是藥學(xué)分子生物學(xué),藥學(xué)分子生物學(xué)與化學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)三部分,使得現(xiàn)在生物合成藥物得到快速發(fā)展,如圖二。1.4 分子生物學(xué)在中藥的研究1.4.1 中藥研究與基因組學(xué)人類基

18、因組學(xué)研究方法內(nèi)容與中醫(yī)學(xué)的整體觀、辨證觀有很多相似之處。如基因組學(xué)研究是在過去對單個基因研究的基礎(chǔ)上認(rèn)識到基因之間相互聯(lián)系的復(fù)雜性,即一種疾病可能由多個基因的改變所致,而同一個基因的不同表達(dá)狀態(tài)又可能造成多種疾病。尤其是從結(jié)構(gòu)研究向功能研究方式的轉(zhuǎn)變,對基因之間相互聯(lián)系相互作用的日趨重視,反映出中醫(yī)藥學(xué)與基因組學(xué)在思維方法上的趨近特征,亦反映了分子生物學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的依據(jù)和前景。近來中醫(yī)藥基因組學(xué)已成為一個非常熱門的話題,有關(guān)部門在研討是否將中醫(yī)證候基因組學(xué)、中藥藥效)基因組學(xué)等列入重點或重大研究課題。試圖仿照人類基因組的研究模式,研究并構(gòu)建中醫(yī)的某一個“證”或某一個中藥或方劑對人類基因

19、組的影響和改變的全息圖或?qū)?yīng)關(guān)系。利于發(fā)現(xiàn)新穎和高效藥物,亦可用于藥物療效的客觀評價。1.4.2 DNA分子標(biāo)記技術(shù)與中藥新藥研發(fā)DNA分子標(biāo)記技術(shù),亦稱DNA分子診斷技術(shù),是指通過直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性來診斷生物內(nèi)在基因排布規(guī)律及其外在性狀表現(xiàn)規(guī)律的技術(shù)。DNA分子標(biāo)記技術(shù)大致可分為兩大類:一類是以電泳技術(shù)和雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù),如DNA指紋技術(shù)。另一類是DNA擴(kuò)增技術(shù)和電泳技術(shù)為核心的分子診斷技術(shù)。在進(jìn)行新藥開發(fā)和中藥資料研究中常需了解中藥有效成分的分布規(guī)律,以便尋找和開發(fā)新藥源。DNA分子標(biāo)記技術(shù)可以像DNA分子標(biāo)記輔助性狀選擇一樣,以指導(dǎo)藥用有效成分方便、快速、正確地尋找與開

20、發(fā)利用。利用分子標(biāo)記技術(shù),尋找與藥用有效成分連鎖的基因或直接應(yīng)用控制該成分的基因標(biāo)記,尋求新資源。1.5 分子生物學(xué)在生藥學(xué)中的研究1.5.1 藥用動植物遺傳多樣性的分子檢測與分子系統(tǒng)學(xué)研究遺傳多樣性是研究系統(tǒng)與進(jìn)化及分類與鑒定的最根本的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而,對于絕大多數(shù)藥用動植物來說,其遺傳背景研究幾乎是一個空白3。利用DNA分子遺傳標(biāo)記和基因組序列分析技術(shù),從居群、分子乃至基因水平上,準(zhǔn)確刻劃藥用動植物遺傳背景差異和親緣關(guān)系,進(jìn)而構(gòu)建基于葉綠體基因組基因和(或)核基因組基因序列分析的重要藥用動植物系統(tǒng)發(fā)育樹,將是分子生藥學(xué)基礎(chǔ)研究的重心。1.5.2 代謝途徑基因工程與中藥材品質(zhì)定向調(diào)控 次生代謝

21、產(chǎn)物合成途徑的基礎(chǔ)研究將越來越受到重視,特別是調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶及其基因與抗病基因的定位、分離和克隆表達(dá)將尤為引人注目,并將成為分子生藥學(xué)研究中最富挑戰(zhàn)和前景的方向之一4。關(guān)鍵酶的確定和分離,不僅為利用生物技術(shù)手段操縱代謝途徑及中藥材品質(zhì)定向調(diào)控提供科學(xué)依據(jù),而且,更為生藥生源學(xué)研究打下堅實基礎(chǔ)。1.5.3 生藥分子藥理學(xué)形成與發(fā)展近年來,中藥藥理方法學(xué)研究進(jìn)展頗快。隨著分子生物學(xué)與中藥藥理學(xué)的發(fā)展,生藥分子藥理學(xué)已現(xiàn)端倪。在分子和基因水平上,研究中藥有效成分或部位的作用機(jī)理、闡明中藥藥性理論及其可能的物質(zhì),建立分子水平上的中藥活性檢測系統(tǒng),或以受體和基因為靶點尋找新藥甚至開展基因治療,

22、將成為分子藥理學(xué)的重要課題。而分子生物學(xué)技術(shù)特別是分子遺傳學(xué)和基因克隆技術(shù),正是研究這一重要課題的關(guān)鍵性手段。受體和基因的結(jié)構(gòu)與功能及其在藥物作用下的變化,中藥作用的受體機(jī)理與受體的藥理學(xué)特性表達(dá),中藥對基因表達(dá)調(diào)控與基因水平上的藥物篩選,藥物代謝酶及其基因的分離確定與中藥誘發(fā)的基因結(jié)構(gòu)異常分析等,將成為生藥分子藥理學(xué)研究中既富挑戰(zhàn)又有前景的新領(lǐng)域1.5.4 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與分子生藥學(xué)方法的創(chuàng)新包括分子遺傳標(biāo)記在內(nèi)的分子生物學(xué)技術(shù)在生藥學(xué)研究中方興未艾,但目前應(yīng)用研究主要表現(xiàn)在生藥鑒定方面,在生藥學(xué)研究深度和廣度方面尚存在很大的局限性。此外,目前常用于生藥鑒定的DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)有R

23、FLP,RAPD,AP-PCR,AFLP等。但與已出現(xiàn)的幾十種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)相比,只是其中的一小部分。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,一方面越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)將滲透應(yīng)用在生藥學(xué)研究中,另一方面新的分子生物學(xué)技術(shù)將不斷問世。 第二章 分子生物學(xué)在醫(yī)藥中的應(yīng)用2.1 分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用2.1.1 基因工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用二十世紀(jì)七十年代初,由于基因重組技術(shù)得到發(fā)展,基因工程逐步發(fā)展成一套成熟的技術(shù)。將需要表達(dá)的產(chǎn)物的目的基因,經(jīng)分離、擴(kuò)增、拼接人一定的載體,然后植入表達(dá)用的菌體(大腸桿菌、酵母菌或真核細(xì)胞),通過生物復(fù)制表達(dá)出所需的產(chǎn)物,經(jīng)分離純化,制成產(chǎn)品。這一過程從研究到工業(yè)化已逐步實現(xiàn)

24、規(guī)范化,并與制藥工業(yè)結(jié)合起來,形成規(guī)?;a(chǎn)。通過分離細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)并擴(kuò)增(RT-PCR)目的基因,經(jīng)純化后用基因重組技術(shù)拼接入載體,轉(zhuǎn)錄載體菌,構(gòu)建工程菌。用生物復(fù)制方法培育工程菌,從工程菌分泌液或包含體中分離表達(dá)產(chǎn)物,經(jīng)過變性和復(fù)性,取得表達(dá)產(chǎn)物的電泳圖譜或少量純品。經(jīng)分析鑒定證明表達(dá)產(chǎn)物是正確的。擴(kuò)大至中試規(guī)模,確定各步工藝的條件至取得一定量的產(chǎn)品,進(jìn)行審批所需的各項檢測及質(zhì)控,并進(jìn)行必要的生物驗證。擴(kuò)大至滿足市場需要的生產(chǎn)規(guī)律,取得規(guī)律生產(chǎn)的效益。2.1.2 基因芯片技術(shù)基因芯片(genechip)又稱DNA芯片、DNA微陣列,是將許多預(yù)先設(shè)計好的寡核苷酸或基因(cDNA)片段作為探

25、針,有序地、高密度地(點與點之間的距離一般小于500km)排列在玻璃、硅片或尼龍膜等載體上,制成DNA微陣列(DNAmicroarmy),將待測樣品DNARNA通過PCRRTPCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子后,與位于芯片上的探針雜交,再通過激光共聚焦熒光掃描系統(tǒng)檢測探針分子雜交信號強(qiáng)度,并配以計算機(jī)對熒光信號進(jìn)行綜合分析后,即可獲得樣品中大量基因序列及表達(dá)的信息,由于常用硅芯片作為固相支持物,且在制備過程運(yùn)用了計算機(jī)芯片的制備技術(shù),所以稱之為基因芯片技術(shù)?;蛐酒N類較多,根據(jù)微陣列上探針的不同,可分為寡核苷酸芯片和cDNA芯片兩類。寡核苷酸芯片是將寡核苷酸原位合成或合成后固定在芯片

26、上,曝露于標(biāo)記樣本DNA雜交,根據(jù)雜交信號出現(xiàn)部位的寡核苷酸序列推測與其互補(bǔ)的DNA序列??捎糜诨虬l(fā)現(xiàn)、突變檢測、表達(dá)監(jiān)控和遺傳制圖等。cDNA芯片是將cDNA固定在芯片上并曝露于一組標(biāo)記探針,可用于大尺度篩選和基因表達(dá)的研究。按照用途可分表達(dá)譜芯片、診斷芯片、指紋圖譜芯片、測序芯片、毒理芯片等。基因芯片的制備方法也可基本分為兩類:一類是原位合成;一類是直接點樣。原位合成是指直接在芯片上用四種核苷酸合成所需的探針;而直接點樣是指將已經(jīng)合成好的探針定位在芯片上,待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必須進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記?;蛐酒夹g(shù)主要包括四個主要步驟:芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)及信號檢測和

27、結(jié)果分析。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的的不同,采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法也各異。為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進(jìn)行標(biāo)記,目前采用的最普遍的是熒光標(biāo)記方法。用計算機(jī)控制的高分辨率熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號,通過計算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。雜交條件的選擇與研究目的有關(guān);多態(tài)性分析或基因測序時,每個核苷酸或突變位點都必須檢測出來;如果芯片僅用檢測基因表達(dá),只需設(shè)計出針對基因中的特定區(qū)域的幾套寡核苷酸即可。表達(dá)檢測需要較長的雜交時間,更高的樣品濃度和低溫度,這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測需要鑒別出單堿基錯配,需要更

28、高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時間。2.1.3 分子生物學(xué)在檢驗醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用上個世紀(jì)八十年代中期。分子生物學(xué)技術(shù)闖世。這種以核酸生化為基礎(chǔ)的新技術(shù)自發(fā)現(xiàn)以來,它已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不可離開的最有價值的診療手段之一。做為檢驗醫(yī)學(xué)的最新方法,它已廣泛應(yīng)用于檢驗學(xué)科的各領(lǐng)域之中。分子生物學(xué)的核心技術(shù)是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),在PCR問世后十幾年的應(yīng)用中它又有了長足的發(fā)展,依托該技術(shù)衍生出的多種反應(yīng)模式,如巢式和半巢式PCR、錨定PcR、恒溫PcR等,此外探針雜交技術(shù)、酶切指紋圖分析技術(shù)、序列分析、各種核酸定量技術(shù)、生物芯片等都已廣泛應(yīng)用于檢驗的臨床和科研工作中。除檢測方法的創(chuàng)造和改進(jìn)外,用于檢測的試劑制備,走人

29、了新的里程碑。上世紀(jì)末單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展,使檢驗試劑特別是用于免疫專業(yè)上的試劑在質(zhì)上有了飛躍進(jìn)步;而依托分子生物學(xué)理論提出的基因生物工程技術(shù),使我們對目的基因的克隆、構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)成為實驗室可實施的技術(shù),極大地提高了檢測試劑質(zhì)量和應(yīng)用范圍。分子生物學(xué)檢測方法涉足檢驗醫(yī)學(xué)的各專業(yè)領(lǐng)域。在臨床血液學(xué)中,血液病特別是白血病的分型,必需依賴分子生物學(xué)技術(shù),已成為常規(guī)診療手段。而萁它出血性疾病為血友病的基因家系研究和優(yōu)生預(yù)測在我國取得讓世人矚目的成績。在妊床生物化學(xué)中,酶類基因的調(diào)控,一些與人體生化反應(yīng)有關(guān)的物質(zhì)的甲基及其在疾病發(fā)生中的作用等均成為研究的熱點問題。在臨床微生物中,更是分子生物學(xué)最重要

30、的用武之地,分子生物學(xué)的應(yīng)用可謂百花齊放。對于些難于捕捉的病原微生物及新病原微生物的確認(rèn),分子生物學(xué)技術(shù)打開了識別它們的禁區(qū),微生物的亞群分析對臨床治療和監(jiān)測提供了有應(yīng)用價值的信息,涉及微生物種類之廣泛,應(yīng)用之有效,信息之有時均達(dá)到前所未有的高度。在臨床免疫方面,涉及參與大體免疫反應(yīng)的基因調(diào)節(jié),人體各類自身免疫病在基因水平上的病因分析及調(diào)控表達(dá)都是分子生物學(xué)參與免疫檢測的契臺點。總之,分子生物學(xué)技術(shù)在檢驗各專業(yè)學(xué)科中應(yīng)用的廣泛程度是任何技術(shù)所不能比擬的。2.1.4 分子生物學(xué)技術(shù)在病理診斷及研究中的應(yīng)用目前,分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各學(xué)科。應(yīng)用到以病變組織或細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察為主的傳統(tǒng)的病理

31、學(xué)后,使得的病理學(xué)研究和診斷深入到基因水平,從遺傳學(xué)的角度揭開疾病的本質(zhì),為科研和臨床輔助診斷做出了巨大的貢獻(xiàn)。熒光原位雜交(fluorescencein situ hybridization,F(xiàn)ISH)在病理中的應(yīng)用是應(yīng)用熒光素等標(biāo)記的探引與組織細(xì)胞中待測核酸反應(yīng)形成雜交體,用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察信號表達(dá)主要用于分裂中期或分裂間期細(xì)胞核的染色體分析。FISH技術(shù)靈敏性高,克服了免疫組化中假陽性高的問題。2.1.5 蛋白質(zhì)芯片在病理中的應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片,又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列,是指以用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他分子作用于以蛋白質(zhì)分予作為配基,有序同定在同相載體表面形成的微陣列,經(jīng)

32、熒光掃描等測定芯片上各點的熒光強(qiáng)度,來分析蛋白質(zhì)之間或蛋白與其它分子之問的相互作用。這是一種高通最、高靈敏度、高特異性且微型化的蛋白質(zhì)分析技術(shù),對疾病的早期病理診斷有一定的作用。2.2分子生物學(xué)在藥學(xué)中的應(yīng)用2.2.1 基因芯片用于藥物篩選 如何分離和鑒定藥物的有效成分是目前新藥開發(fā)遇到的重大障礙,基因芯片技術(shù)是解決這一障礙的有效手段,它能夠大規(guī)模地篩選,在藥物和基因之間架起一座橋梁,從基因水平解釋藥物的作用機(jī)制,即可以利用基因芯片分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)的差異,從而發(fā)現(xiàn)一組病癥相關(guān)基因和藥物效應(yīng)基因作為藥物篩選靶標(biāo)。如果用mRNA構(gòu)建 cDNA表達(dá)文庫,然后用得到的肽庫制作肽

33、芯片,則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質(zhì)。如果用 cDNA作為探針的基因芯片,則可進(jìn)行反義寡核苷酸類藥物的篩選?;蛘撸肦NA ,單鏈 DNA有很大的柔性,能形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu),更有利與靶分子相結(jié)合,可將核酸庫中的 RNA或單鏈 DNA固定在芯片上,然后與靶蛋白孵育,形成蛋白質(zhì) RNA或蛋白質(zhì)DNA 復(fù)合物,可以篩選特異的藥物蛋白或核酸,因此基因芯片技術(shù)和 RNA庫的結(jié)合在藥物篩選中將得到廣泛應(yīng)用。2.2.2 生物工程與生物制藥分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展極大地推動了藥物的研制。在傳統(tǒng)的化學(xué)藥物和中草藥之外,形成了生物制藥這一新興領(lǐng)域,生物工程的幾大領(lǐng)域均在生物制品方面取得了巨大進(jìn)

34、展。目前世界采用基因工程技術(shù)制備的多肽藥物已打100種以上,如人胰島素、人生長激素、干擾素、白介素、集落刺激因子等。蛋白質(zhì)工程在過去主要采用化學(xué)方法對純化蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,制備出有特殊功能的蛋白質(zhì),現(xiàn)在主要應(yīng)用基因工程技術(shù),從改造目的基因的結(jié)構(gòu)入手,在受體細(xì)胞中表達(dá)不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。微生物工程又稱為發(fā)酵工程,是利用微生物特定性狀,使微生物產(chǎn)生有用物質(zhì)或直接用于工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)。用重組DNA技術(shù)創(chuàng)造抗生素新品種已獲得進(jìn)展。運(yùn)用重組DNA技術(shù)不僅可以創(chuàng)造新的抗生素而且可以提高產(chǎn)量。2.2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在藥學(xué)研究中的應(yīng)用2.2.3.1蛋白質(zhì)組學(xué)識別和驗證藥物作用的靶點新藥研究是一個不斷推陳出新的

35、過程,新的藥物作用靶點就是體現(xiàn)其新穎性的標(biāo)志之一。如果以人類主要的 100-150種疾病進(jìn)行粗略估計,人體內(nèi)可能存在的藥物靶點約有 3000-15000個,而統(tǒng)計結(jié)果顯示,目前的藥物靶點不到 500個,這說明還有大量的未知靶點等待我們?nèi)ラ_發(fā)。大多數(shù)藥物靶點都是在生命活動中扮演重要角色的蛋白質(zhì),如酶,受體,激素等。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法比較疾病狀態(tài)和生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,就有可能找到有效的藥物作用靶點。蛋白質(zhì)組學(xué)探索藥物的耐藥機(jī)制,抗生素自問世以來,使傳染性疾病的死亡率大大降低,挽救了無數(shù)人的生命。但是,越來越多的病原微生物出現(xiàn)耐藥性,給藥物特別是抗生素的應(yīng)用提出了嚴(yán)峻的考驗。病原微生物、腫

36、瘤細(xì)胞和機(jī)體的耐藥性的形成與多種蛋白質(zhì)改變的關(guān)系更為密切,因而研究給藥后敏感細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株差異表達(dá)的蛋白質(zhì)對于了解藥物的耐藥機(jī)制顯得尤為重要。2.2.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)用于藥物作用強(qiáng)度及藥物毒理學(xué)研究新藥的主要藥效學(xué)評價的目的是明確受試化合物的作用強(qiáng)度和特點,與已知藥物相比有何特點,是否值得進(jìn)一步評價。通常要求作出藥物的量效關(guān)系曲線,求出半數(shù)有效量(ED50)再與已知的同類藥比較。如果用蛋白質(zhì)的表達(dá)水平來替代效應(yīng)參數(shù),將會使這一標(biāo)準(zhǔn)更加精確有效。蛋白質(zhì)組學(xué)的另一應(yīng)用就是研究藥物毒理學(xué),方法是比較正常細(xì)胞和給藥后細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的變化。經(jīng)典實驗是在研究環(huán)孢素A(cycloporine A

37、,CsA)的腎臟毒性時,用CsA處理小鼠后,在2-DE圖譜上發(fā)現(xiàn)其腎臟蛋白中一種鈣結(jié)合蛋白下調(diào)5,而生理狀態(tài)下,這種鈣結(jié)合蛋白參與鈣離子的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)它在腎臟的表達(dá)豐度減弱時,就會導(dǎo)致腎小管鈣化,影響其他物質(zhì)的代謝,產(chǎn)生腎臟毒性。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)用于研究藥物引起肝腎毒性的作用機(jī)制的例子不勝枚舉,fountoulakis等6和ruepp等7就分別研究了對乙酰氨基酚的肝臟毒性機(jī)制。經(jīng)過初步研究,已有學(xué)者嘗試用特異表達(dá)的蛋白質(zhì)作為信號分子來研究藥物產(chǎn)生肝毒性的分子機(jī)制8。 第三章 應(yīng)用前景如此繁多的納米材料及納米產(chǎn)品將被納米技術(shù)拓寬應(yīng)用領(lǐng)域,同時也為提高生物醫(yī)藥技術(shù)、尋找和開發(fā)生物醫(yī)藥材料、合成理

38、想的藥物提供了充足的技術(shù)保證。未來發(fā)展目標(biāo)是根據(jù)需要組合原子或分子制造植物和動物,將極大地沖擊以至改變?nèi)祟悅鹘y(tǒng)的生活和生產(chǎn)方式。生物納米材料應(yīng)用分子生物學(xué)。生命有機(jī)體給了人們以啟示,通過細(xì)菌的不斷繁殖,可以看到,只要給予空間和一些普通的物質(zhì)(如垃圾)。分子體系就能復(fù)制出它們本身。這就使我們想到,一個能收集原子并按照指令把它們裝配起來的裝置也可能再生。這也許需要一臺計算機(jī)對它發(fā)出指令,還需要一盤程序帶來貯存這些指令,然而它自身就會復(fù)制出一臺一模-樣的計算機(jī)和程序帶,從而復(fù)制出整個裝置來。每復(fù)制一次,再生體就增加一倍。這種幾何級數(shù)的增加只要幾個小時至幾天,一個極其微小的再生體就可能把1噸原料及某些燃料變成1噸幾乎能制造萬物的總裝配機(jī)。這些機(jī)器可能進(jìn)一步用來制造其它產(chǎn)品,如小型計算機(jī),高強(qiáng)度金剛石纖維工業(yè)用合成肌肉供打碎巖石和分離純金屬用的分子機(jī)器等。生物學(xué)家已經(jīng)利用分于機(jī)器研究細(xì)胞,他們還用酶幫助鑒定化學(xué)藥物,用抗體標(biāo)示蛋白質(zhì),利用病毒注射器把DNA引入到細(xì)菌里去。隨著分子機(jī)器和計算機(jī)

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