生化分離技術(shù)實踐教學(xué)大綱

1、生化分離技術(shù)實驗教學(xué)大綱一、實驗教學(xué)內(nèi)容與基本要求實驗一 用溶劑萃取法提取與精制紅霉素（一）目的要求1掌握溶劑萃取法提取微生物藥物的原理和方法。2掌握溶劑萃取法提取微生物藥物的步驟和操作要求。（二）實驗內(nèi)容紅霉素可在堿性條件下溶于乙酸乙酯有機溶劑中，在酸性條件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成鉀鹽沉淀析出。（三） 所需實驗設(shè)施設(shè)備1材料 2g紅霉素軟膏。2器材 量杯、燒杯、布氏漏斗及配套抽濾瓶、培養(yǎng)皿、分液漏斗、鐵架及鐵圈、玻璃棒、鑷子、剪刀、不銹鋼扁匙、PH試紙、濾紙及紡綢布、真空烘箱。3試劑乙酸、乙酸乙酯（BA）、飽和食鹽水、異丙醇、乙醇-醋酸鉀溶液。（四） 教學(xué)形式及過程1.講解實驗過程

2、及注意事項，20分鐘。2.4人一組，分組實驗。實驗二 等電點沉析法分離牛乳中的酪蛋白（一）目的要求1學(xué)習(xí)從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法。2掌握等電點沉析分離的基本操作技術(shù)。（二）實驗內(nèi)容蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核酸等都是兩性電解質(zhì)，當(dāng)其溶液在某一pH值時，這些生物大分子的所帶的正負電荷數(shù)目相等而呈電中性，此時溶液的pH值稱為該物質(zhì)的等電點。生物大分子在其等電點的溶液中，溶解度最低，易發(fā)生沉淀，一般疏水性較強的蛋白質(zhì)可用此法分離。（三） 所需實驗設(shè)施設(shè)備1材料 鮮牛奶。2試劑醋酸鈉、優(yōu)級純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.2mol/L pH 4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液。3器具燒杯（100 mL、）、

3、玻璃棒、滴管、量筒、離心機、水浴鍋、布氏漏斗、精密pH試紙或酸度計、表面皿、電子天平、抽濾瓶。（四） 教學(xué)形式及過程1.講解實驗過程及注意事項，30分鐘。2.4人一組，分組實驗。實驗三 離子交換法分離氨基酸（一）目的要求學(xué)習(xí)用陽離子交換樹脂柱分離氨基酸的操作方法和原理。（二）實驗內(nèi)容本實驗采用磺酸型陽離子交換樹脂分離酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量為133.1）和堿性氨基酸賴氨酸（Lys，pI=9.74，分子量為146.2）的混合液。在pH=5.3條件下，因為pH值低于Lys的pI值，Lys可解離成陽離子結(jié)合在樹脂上；Asp可解離成陰離子，不被樹脂吸附而流出層析柱。在pH=1

4、2條件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解離成陰離子從樹脂上被交換下來。這樣，通過改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達到分離的目的。（三） 所需實驗設(shè)施設(shè)備1材料 磺酸型陽離子交換樹脂（732型）2試劑樹脂處理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L檸檬酸緩沖液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH緩沖液（pH=12）、天冬氨酸、賴氨酸、茚三酮、無水乙醇。3器具離子交換色譜柱、量筒、吸管、收集器、試管、恒流泵。（四） 教學(xué)形式及過程1.講解實驗過程及注意事項，20分鐘。2.4人一組，分組實驗。實驗四 垂直板

5、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)（一）目的要求學(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)測定蛋白質(zhì)的分子量的原理和基本操作技術(shù)。（二）實驗內(nèi)容蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下解離而帶電荷。當(dāng)溶液的pH大于蛋白質(zhì)的等電點(pI)時，蛋白質(zhì)本身帶負電，在電場中將向正極移動。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中存在的濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)，使不同的蛋白質(zhì)在同一電場中達到有效的分離。（三） 所需實驗設(shè)施設(shè)備1材料 標準蛋白混合液 內(nèi)含：磷酸化酶(Mw94，000)，牛血清蛋白(Mw67，000)，肌動蛋白(Mw43，000)，磷酸酐酶(Mw30，000)和溶菌酶(Mw14，000)2試劑30

6、凝膠貯備液、分離膠緩沖液(1.5molL)、濃縮膠緩沖液、電極緩沖液(pH8.3)、10SDS、10過硫酸銨(新鮮配制)、1TEMED、上樣緩沖液、0.25考馬斯亮藍R-250染色液、脫色液、未知分子量的蛋白質(zhì)樣品3實驗器材DYCZ-24D垂直板電泳槽(北京市六一儀器廠)、電泳儀、長滴管及微量加樣器、燒杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、250m1)、培養(yǎng)皿(15cm´l5cm)、注射器等。（四） 教學(xué)形式及過程1.講解實驗過程及注意事項，20分鐘。2.4人一組，分組實驗。實驗五 乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠（一）目的要求1乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠的基本原理。2掌握有

7、機溶劑沉析法的基本操作技術(shù)。（二）實驗內(nèi)容柑橘皮中果膠含量很高，大部分以果膠質(zhì)形式存在，果膠質(zhì)不溶于水，但用稀酸可將其水解為可溶性果膠，利用多糖類物質(zhì)在乙醇中的溶解度的不同，加入一定量乙醇使其沉析，就可使果膠從溶液中析出，經(jīng)分離、干燥即得果膠純品。（三） 所需實驗設(shè)施設(shè)備1材料 新鮮柑橘皮50g2試劑正磷酸、O.2molL鹽酸、焦磷酸鈉（又稱磷酸四鈉）、80乙醇、95乙醇、硅藻土粉末。3器具組織搗碎機、大燒杯（500mL）、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、搪瓷桶、酸度計、不銹鋼鍋、板框壓濾機。（四） 教學(xué)形式及過程1.講解實驗過程及注意事項，20分鐘。2.4人一組，分組實驗。實驗六 海帶中甘露醇的制備

8、及鑒定（一）目的要求1了解甘露醇的理化性質(zhì)；2掌握從海帶中分離提純甘露醇的原理和基本操作技術(shù)。（二）實驗內(nèi)容以海帶為原料，用自來水浸泡提取甘露醇；通過調(diào)節(jié)酸度，沉淀除雜質(zhì)；煮沸濃縮后用乙醇沉淀甘露醇；最后通過回流、重結(jié)晶、活性炭脫色等工藝精制甘露醇。（三） 所需實驗設(shè)施設(shè)備1材料 海藻或海帶、粉末活性炭2試劑30NaOH、硫酸-水混合液(1：1)、95乙醇、1molL三氯化鐵溶液、1molLNaOH溶液3器具電瓷爐、不銹鋼鍋、布式漏斗、抽濾瓶、回流裝置、pH試紙（四） 教學(xué)形式及過程1.講解實驗過程及注意事項，20分鐘。2.4人一組，分組實驗。二、實驗課程學(xué)時分配表序號實驗項目名稱實驗學(xué)時每組

9、人數(shù)實驗屬性實驗類別實驗要求內(nèi)容提要1用溶劑萃取法提取與精制紅霉素44專業(yè)基礎(chǔ)類操作性必做紅霉素可在堿性條件下溶于乙酸乙酯有機溶劑中，在酸性條件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成鉀鹽沉淀析出。2等電點沉析法分離牛乳中的酪蛋白44專業(yè)基礎(chǔ)類操作性必做牛乳中的酪蛋白是兩性電解質(zhì)，當(dāng)其溶液在某一pH值，即等電點時，溶解度最低，易發(fā)生沉淀，一般疏水性較強的蛋白質(zhì)可用此法分離。3離子交換法分離氨基酸44專業(yè)基礎(chǔ)類驗證性必做氨基酸是兩性電解質(zhì)，分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點和溶液的pH值，各種氨基酸分子結(jié)構(gòu)不同，在同一pH值時所帶電荷的性質(zhì)（正、負）和多少不同，與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可根據(jù)

10、親和力從小到大的順序被洗脫液分別洗脫下來，達到分離的效果。4垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)44專業(yè)類驗證性必做蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下解離而帶電荷。當(dāng)溶液的pH大于蛋白質(zhì)的等電點(pI)時，蛋白質(zhì)本身帶負電，在電場中將向正極移動。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中存在的濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)，使不同的蛋白質(zhì)在同一電場中達到有效的分離。5乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠44專業(yè)類綜合性必做柑橘皮中果膠含量很高，大部分以果膠質(zhì)形式存在，果膠質(zhì)不溶于水，但用稀酸可將其水解為可溶性果膠，利用多糖類物質(zhì)在乙醇中的溶解度的不同，加入一定量乙醇使其沉析，就可使果膠從溶液中析出，經(jīng)分離、干燥即得

11、果膠純品。6海帶中甘露醇的制備及鑒定44專業(yè)類綜合性必做以海帶為原料，用自來水浸泡提取甘露醇；通過調(diào)節(jié)酸度，沉淀除雜質(zhì)；煮沸濃縮后用乙醇沉淀甘露醇；最后通過回流、重結(jié)晶、活性炭脫色等工藝精制甘露醇。三、與其它相關(guān)課程的聯(lián)系與分工本課程實驗與有機化學(xué)、生物化學(xué)等基礎(chǔ)課實驗具有一定的聯(lián)系，為專業(yè)基礎(chǔ)課或?qū)I(yè)類實驗，讓學(xué)生具有生產(chǎn)各種生化產(chǎn)品的基本理論和技能，適應(yīng)不同類型生化工廠及今后從事科學(xué)研究工作的需要。四、考核方式本門課程各實驗必須完成實驗報告，要求實驗報告格式規(guī)范、列出當(dāng)次實驗的目的、要求、實驗內(nèi)容以及自己的完成情況。實驗課成績占課程總成績的比例為30%。五、實驗指導(dǎo)書、參考書劉葉青. 生物

12、分離工程實驗.北京. 高等教育出版社.2007年。張龍翔. 生化實驗方法和技術(shù).北京. 高等教育出版社.2006年。16 / 16文檔可自由編輯打印生化分離技術(shù)實驗指導(dǎo)書實驗一 用溶劑萃取法提取與精制紅霉素實驗實驗項目名稱：用溶劑萃取法提取與精制紅霉素實驗項目性質(zhì)：專業(yè)基礎(chǔ)類所屬課程名稱： 生物技術(shù)原理試驗計劃學(xué)時： 4一、實驗的目的通過本實驗的學(xué)習(xí)，使學(xué)生了解溶劑萃取法提取微生物藥物的原理和方法，掌握溶劑萃取法提取微生物藥物的步驟和操作要求。二、實驗內(nèi)容和要求教師講解實驗過程及注意事項后，4人一組，進行操作實驗。三、本實驗的基本原理和方法紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，可在堿性條件下溶于乙酸乙酯有

13、機溶劑中，在酸性條件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成鉀鹽沉淀析出。四、實驗主要儀器設(shè)備和材料1材料 2g紅霉素軟膏2器材 量杯、燒杯、布氏漏斗及配套抽濾瓶、培養(yǎng)皿、分液漏斗、鐵架及鐵圈、玻璃棒、鑷子、剪刀、不銹鋼扁匙、PH試紙、濾紙及紡綢布、真空烘箱。3試劑乙酸、乙酸乙酯（BA）、飽和食鹽水、異丙醇、乙醇-醋酸鉀溶液（配制方法：取醋酸鉀10g溶于100mL于水乙醇中，配成飽和溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配）五、實驗方法、步驟（一）取2g紅霉素軟膏，放入燒杯中，加6ml乙酸丁酯，用乙酸或乙酸丁酯調(diào)pH值為 7.2 8.0，抽濾，得澄清濾液，供下一步萃取用。（二）澄清濾液放入搪瓷缸中用乙酸酸化pH值為3.56.

14、0，加乙酸丁酯分兩次（每次加1020ml）進行萃取，每次加入后，要在搪瓷缸內(nèi)上下翻動，使濾液和乙酸丁酯能充分混合接觸，然后靜置30 min使之分層，用100ml燒杯收集上層萃取液。（三）取上述下相液，加入一定體積的飽和食鹽水，加入乙酸乙酯分兩次萃取，充分混合接觸，待靜置分層后，將上層萃取液（BA液）傾倒出或吸出，轉(zhuǎn)入另一只燒杯中。（四）結(jié)晶與干燥：量取乙醇-醋酸鉀溶液，緩慢加入上述BA液中，待有沉淀產(chǎn)生時，攪拌后靜置30min后過濾，得紅霉素晶體，將濕晶體放入燒杯中，加異丙醇3050ml，攪拌成糨糊狀，然后過濾抽提，將濕品平鋪培養(yǎng)皿，可置真空干燥箱干燥得干品。六、實驗報告要求認真書寫實驗報告，

15、做好實驗現(xiàn)象的描述、實驗結(jié)果的分析，要求記錄清楚，并對實驗方案提出改進的意見等。七、實驗中的注意事項1通過調(diào)節(jié)溶液的pH值使紅霉素轉(zhuǎn)入有機溶劑相或水相，應(yīng)注意控制溶液的pH值。2注意萃取時避免乳化現(xiàn)象。八、思考題1常用的萃取溶劑有哪些？2為何選用飽和食鹽水？九、其它說明 無。實驗二 等電點沉析法分離牛乳中的酪蛋白實驗項目名稱：等電點沉析法分離牛乳中的酪蛋白實驗項目性質(zhì)：專業(yè)基礎(chǔ)類所屬課程名稱： 生物技術(shù)原理試驗計劃學(xué)時： 4一、實驗的目的通過本實驗的學(xué)習(xí)，使學(xué)生了解從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法，掌握等電點沉析分離的基本操作技術(shù)。二、實驗內(nèi)容和要求教師講解實驗過程及注意事項后，4人一組，進行操

16、作實驗。三、本實驗的基本原理和方法蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核酸等都是兩性電解質(zhì)，當(dāng)其溶液在某一pH值時，這些生物大分子的所帶的正負電荷數(shù)目相等而呈電中性，此時溶液的pH值稱為該物質(zhì)的等電點。生物大分子在其等電點的溶液中，溶解度最低，易發(fā)生沉淀，一般疏水性較強的蛋白質(zhì)可用此法分離。四、實驗主要儀器設(shè)備和材料1材料 鮮牛奶2試劑醋酸鈉、優(yōu)級純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.2mol/L pH 4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液其配制如下：配A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液，稱NaAc·H2O 5.44g溶至200mL。配B液：0.2mol/L醋酸溶液，稱優(yōu)級純醋酸2.4g溶至200mL。取A液約1

17、7.7mL，B液約12.3mL混合，用酸度計調(diào)得pH 4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液30mL。3器具燒杯（100 mL、）、玻璃棒、滴管、量筒、離心機、水浴鍋、布氏漏斗、精密pH試紙或酸度計、表面皿、電子天平、抽濾瓶五、實驗方法、步驟1.將鮮牛奶30 ml及醋酸-醋酸鈉緩沖液30ml分別水浴加熱40左右。并用8層紗布過濾牛奶。2.量取加熱后的牛奶20ml。在攪拌下慢慢加入加熱后的醋酸-醋酸鈉緩沖液20ml。用酸度計調(diào)pH至4.7。3.將上述混合液冷至室溫，離心（3500r/min）15min，棄去上清液，得酪蛋白粗制品。4.用水洗沉淀3次，離心（3500r/min）10min，棄去上清液5.在沉淀中

18、加入20ml乙醇，攪拌片刻。將全部的懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。6.將沉淀攤開在表面皿上，風(fēng)干得酪蛋白純品。7.準確稱量，計算含量和收率。含量=酪蛋白g/100mL牛乳測得含量理論含量收率=×100%式中理論含量為3.5g/100mL牛乳。 六、實驗報告要求認真書寫實驗報告，做好實驗現(xiàn)象的描述、實驗結(jié)果的分析，要求記錄清楚，并對實驗方案提出改進的意見等。七、實驗中的注意事項1醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制應(yīng)規(guī)范，pH值應(yīng)用酸度計測試，以準確達到酪蛋白的等電點。2.加入醋酸-醋酸鈉緩沖液時，動作要緩慢，并慢慢加入，不可操之過急而大量一

19、次加入。3.離心前溫度一定要降至室溫。八、思考題1為何用醋酸-醋酸鈉緩沖液來調(diào)酪蛋白的等電點，可否改用酸或堿來？2如何提高酪蛋白的收率？九、其它說明 無。實驗三 離子交換法分離氨基酸實驗項目名稱：離子交換法分離氨基酸實驗項目性質(zhì)：專業(yè)基礎(chǔ)類所屬課程名稱： 生物技術(shù)原理試驗計劃學(xué)時： 4一、實驗的目的通過本實驗的學(xué)習(xí)，使學(xué)生了解離子交換樹脂分離氨基酸基本原理，掌握陽離子交換樹脂處理技能和分離氨基酸的操作步驟。二、實驗內(nèi)容和要求教師講解實驗過程及注意事項后，4人一組，進行操作實驗。三、本實驗的基本原理和方法有些高分子物質(zhì)含有一些可以解離的基團，因此可以和溶液中的離子產(chǎn)生交換反應(yīng)。這類高分子物質(zhì)統(tǒng)稱

20、離子交換劑，其中使用的最普遍的是離子交換樹脂。由于一定離子交換劑對于不同離子的靜電引力不同，因此在洗脫過程中，不同的離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后完全分離。本實驗采用磺酸型陽離子交換樹脂分離酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量為133.1）和堿性氨基酸賴氨酸（Lys，pI=9.74，分子量為146.2）的混合液。在pH=5.3條件下，因為pH值低于Lys的pI值，Lys可解離成陽離子結(jié)合在樹脂上；Asp可解離成陰離子，不被樹脂吸附而流出層析柱。在pH=12條件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解離成陰離子從樹脂上被交換下來。這樣，通過改變洗脫液的pH值可使它們被分

21、別洗脫而達到分離的目的。四、實驗主要儀器設(shè)備和材料1材料 磺酸型陽離子交換樹脂（732型）2試劑樹脂處理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L檸檬酸緩沖液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH緩沖液（pH=12）、天冬氨酸、賴氨酸、茚三酮、無水乙醇。3器具離子交換色譜柱、量筒、吸管、收集器、試管、恒流泵。五、實驗方法、步驟（一）新樹脂的處理和轉(zhuǎn)型1干樹脂用蒸餾水充分浸泡膨脹后，傾去細小顆粒，然后用4倍體積的2mol/L HCL和2mol/L NaOH依次浸洗攪拌30min，并分別用蒸餾水洗至中性（最后應(yīng)處理至溶液無

22、黃色）。2再用1mol/L NaOH浸泡510 min，使樹脂轉(zhuǎn)為鈉型。以蒸餾水洗去NaOH至樹脂pH呈中性（大約洗23次）。（二）裝柱前準備用蒸餾水沖洗層析柱，將層析柱垂直裝好，在柱流水出口處裝上乳膠管，關(guān)閉柱底出口（或使用調(diào)控閥），在柱內(nèi)加入23cm高的檸檬酸緩沖液，排出乳膠管內(nèi)氣泡，抬高乳膠管出口，防止柱內(nèi)緩沖液排空。（三）裝柱將處理好的樹脂放入燒杯中，加入1倍2倍體積的檸檬酸緩沖液并攪拌成懸浮狀，沿柱內(nèi)壁緩慢流入裝柱，待樹脂自然下沉在柱底部逐漸沉積23cm高時，慢慢打開柱底出口，再繼續(xù)加入樹脂懸液直至樹脂沉積高度為1618cm時為止。裝柱要求連續(xù)、均勻，無分層、無氣泡等現(xiàn)象產(chǎn)生，必須防

23、止液面低于樹脂平面，否則要重新裝柱。（四）平衡層析柱裝好后，再緩慢沿管壁加滿檸檬酸緩沖液，接上恒流泵，用檸檬酸緩沖液以5滴/min流速平衡40min左右，直至用pH試紙測得流出液的pH與緩沖液的pH相等為止。（五）加樣與洗脫1移去層析柱上連接泵的橡膠管，打開柱底出口，小心使柱內(nèi)緩沖液的液面與樹脂平面幾乎相平時即行關(guān)閉（注意：不要是樹脂露出液面）。馬上用加樣器吸取氨基酸混合樣品0.5ml，沿靠近樹脂表面的管壁慢慢加入（注意不要破壞樹脂平面），然后緩慢打開柱底管夾，使液面再與樹脂面相齊時關(guān)閉。2然后加少量檸檬酸緩沖液清洗內(nèi)壁23次，使樣品進入柱內(nèi)。當(dāng)樣品完全進入樹脂床內(nèi)，即可接上恒流泵，調(diào)流速0.

24、5ml/min，開始洗脫。（六）收集柱洗脫液可用自動分部收集器或以刻度試管人工收集，按每管3ml先收集5管。（七）改用pH=12 NaOH緩沖液洗脫收集關(guān)閉恒流泵和柱底夾，將洗脫液更換為pH=12 NaOH緩沖液，然后按上面同樣方法繼續(xù)收集第6管到第10管。（八）測定將收集的洗脫液各管編好號后，分別取0.5ml收集于一潔凈的試管中，加入檸檬酸緩沖液（pH=5.3）1ml，茚三酮顯色液0.5ml，混合后置沸水水浴加熱15min，取出，用冷水冷卻。六、實驗報告要求認真書寫實驗報告，做好實驗現(xiàn)象的描述、實驗結(jié)果的分析，要求記錄清楚，并對實驗方案提出改進的意見等。七、實驗中的注意事項1.為使分離色帶整

25、齊，裝柱時層析柱一定要無裂縫和氣泡。2.分離洗脫過程中，要連續(xù)不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在整個操作中絕不能使樹脂表面的液體流干。3.一直保持流速10滴/min12滴/ min，并注意勿使樹脂表面干燥。八、思考題1離子交換樹脂用緩沖液平衡，為什么又用緩沖液沖洗？2何謂氨基酸的離子交換？本實驗采用的離子交換劑屬于哪一種？九、其它說明 無。實驗三 垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)實驗項目名稱：垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)實驗項目性質(zhì)：專業(yè)類所屬課程名稱： 生物技術(shù)原理試驗計劃學(xué)時： 4一、實驗的目的通過本實驗的學(xué)習(xí)，使學(xué)生學(xué)習(xí)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)測定蛋

26、白質(zhì)的分子量的原理，掌握電泳的基本操作技術(shù)。二、實驗內(nèi)容和要求教師講解實驗過程及注意事項后，4人一組，進行操作實驗。三、本實驗的基本原理和方法蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下解離而帶電荷。當(dāng)溶液的pH大于蛋白質(zhì)的等電點(pI)時，蛋白質(zhì)本身帶負電，在電場中將向正極移動；當(dāng)溶液的pH小于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)帶正電，在電場中將向負極移動；蛋白質(zhì)在特定電場中移動的速度取決于其本身所帶的凈電荷的多少、蛋白質(zhì)顆粒的大小和分子形狀、電場強度等。聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu)。本實驗采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，調(diào)整雙丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔徑的兩層凝膠；這樣

27、，當(dāng)含有不同分子量的蛋白質(zhì)溶液通過這兩層凝膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。由于上層膠的孔徑較大，不同大小的蛋白質(zhì)分子在通過大孔膠時，受到的阻滯基本相同，因此以相同的速率移動；當(dāng)進入小孔膠時，分子量大的蛋白質(zhì)移動速度減慢，因而在兩層凝膠的界面處，樣品被壓縮成很窄的區(qū)帶。這就是常說的濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。同時，在制備上層膠(濃縮膠)和下層膠(分離膠)時，采用兩種緩沖體系；上層膠pH=6.7-6.8，下層膠pH8.9；Tris-HCI緩沖液中的Tris用于維持溶液的電中性及pH，是緩沖配對離子；CI-是前導(dǎo)離子。在pH6.8時，緩沖液中的Gly-為尾隨離子，而在pH8.9時，Gly的解離

28、度增加；這樣濃縮膠和分離膠之間pH的不連續(xù)性，控制了慢離子的解離度，進而達到控制其有效遷移率之目的。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，在進入分離膠后，各種蛋白質(zhì)由于所帶的靜電荷不同，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中存在的濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)，使不同的蛋白質(zhì)在同一電場中達到有效的分離。如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)，由于SDS帶有大量的負電荷，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是在強還原劑如巰基乙醇存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合，形成帶負電性的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物；此時，蛋白質(zhì)分子上所帶的負電荷

29、量遠遠超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷上的差異。蛋白質(zhì)分子量愈小，在電場中移動得愈快；反之，愈慢。蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率之間的關(guān)系是：Mr=K(10-bm)logMr=LogK-bRm，式中Mr-蛋白質(zhì)的分子量；logK-截距；b-斜率；Rm-相對遷移率。實驗證明，蛋白質(zhì)分子量在15，000-200，000的范圍內(nèi)，電泳遷移率與分子量的對數(shù)之間呈線性關(guān)系。蛋白質(zhì)的相對遷移率Rm蛋白質(zhì)樣品的遷移距離染料(溴酚藍)遷移距離。這樣，在同一電場中進行電泳，把標準蛋白質(zhì)的相對遷移率與相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量對數(shù)作圖，由未知蛋白的相對遷移率可從標準曲線上求出它的分子量。SDS-聚丙烯酰

30、胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測定蛋白質(zhì)的分子量具有簡便、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點，是目前一般實驗室常用的測定蛋白質(zhì)分子量的方法。四、實驗主要儀器設(shè)備和材料1材料 標準蛋白混合液 內(nèi)含：磷酸化酶(Mw94，000)，牛血清蛋白(Mw67，000)，肌動蛋白(Mw43，000)，磷酸酐酶(Mw30，000)和溶菌酶(Mw14，000)2試劑1)標準蛋白混合液內(nèi)含：磷酸化酶(Mw94，000)，牛血清蛋白(Mw67，000)，肌動蛋白(Mw43，000)，磷酸酐酶(Mw30，000)和溶菌酶(Mw14，000)2)30凝膠貯備液：Acr30g，Bis0.8g，加蒸餾水至100mL3)分離膠緩沖液(1

31、.5molL):Tris18.15g，加水溶解，6mol/LHCl調(diào)pH8.9，定容100mL4)濃縮膠緩沖液(0.5molL):Tris6g，加水溶解，6mol/LHCl調(diào)pH6.8，并定容到100mL5)電極緩沖液(pH8.3)：SDSlg，Tris6g，Gly28.8g，加水溶解并定容到1000mL。用時稀釋五倍。6)10SDS7)10過硫酸銨(新鮮配制)8)1TEMED9)上樣緩沖液：0.5molLTris-HClpH6.81.25mL，50甘油4mL，10SDS2mL，巰基乙醇0.4mL，0.1溴酚藍0.4mL，加蒸餾水定溶至10mL。10)0.25考馬斯亮藍R-250染色液：考馬斯

32、亮藍R-2501.25g，50甲醇454mL，冰乙酸46mL。11)脫色液：冰乙酸35mL，蒸餾水465mL。12)未知分子量的蛋白質(zhì)樣品(1mgmL)3實驗器材DYCZ-24D垂直板電泳槽(北京市六一儀器廠)、電泳儀、長滴管及微量加樣器、燒杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、250m1)、培養(yǎng)皿(15cm´l5cm)、注射器等五、實驗方法、步驟1裝板將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后插入斜插板到適中程度，即可灌膠。2凝膠的聚合分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置10

33、的分離膠和4.8的濃縮膠。試劑名稱10%的分離膠/mL4.8%的濃縮膠/mLAcr/Bis30%分離膠緩沖液（pH8.9）濃縮膠緩沖液（pH6.8）10%SDS10%過硫酸銨水TEMED53.7500.150.1511.601.250.10.14.951按上表各液加入混勻后配制成分離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩用滴管滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡。將膠液加到距短玻璃板上沿2cm處為止，約5mL。然后用細滴管或注射器仔細注入少量水，約0.5-1mL。室溫放置聚合30-40min。待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分，按上表制備濃縮膠。用長滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子(

34、梳子)；待濃縮膠聚合后，小心拔出樣品模子。3蛋白質(zhì)樣品的處理若標準蛋白質(zhì)或欲分離的蛋白質(zhì)樣品是固體，稱取lmg的樣品溶解于lmL0.5molLpH6.8Tris-鹽酸緩沖液或蒸餾水中；若樣品是液體，要測定蛋白質(zhì)濃度，按1.01.5mgmL溶液比例，取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻。本實驗所用樣品為1520mg的標準蛋白樣品溶液，放置在0.5mL的離心管中，加入15-20ml的樣品處理液。在100水浴中處理2min，冷卻至室溫后備用。吸取未知分子量的蛋白質(zhì)樣品20ml，按照標準蛋白的處理方法進行處理。4加樣SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法：用手夾住兩塊玻璃板，上提斜插板使其松開，然

35、后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠框，注意在上述過程中手始終給玻璃膠室一個夾緊力，再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽，插入斜板，將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上，外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可，注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡。加樣時可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準確定位加樣位置，或用微量注射器依次在各樣品槽內(nèi)加樣，各加1015ml(含蛋白質(zhì)1015mg)，稀溶液可加2030ml(還要根據(jù)膠的厚度靈活掌握)。5電泳加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后，樣品進膠前電流控制在1520mA，大約1520min；樣品中的溴酚藍指示劑到達分離膠之后，電流升到3045mA，電泳過程保持電流穩(wěn)定。當(dāng)

36、溴酚藍指示劑遷移到距前沿12cm處即停止電泳，約1-2小時。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水，降低電泳溫度。6染色、脫色電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入銅絲作為標志，放入大培養(yǎng)皿中染色，使用0.25的考馬斯亮藍染液，染色24h，必要時可過夜。棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進行擴散脫色，經(jīng)常換脫色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止。7結(jié)果處理1)測量脫色后凝膠板的長度和每個蛋白質(zhì)樣品移動距離(即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔的距離)，測量指示染料遷移的距離。2)按以下公式計算蛋白質(zhì)樣品的相對遷

37、移率(Rm)相對遷移率樣品遷移距離(cm)染料遷移距離(cm)3)標準曲線的制作：以各標準蛋白質(zhì)相對遷移率為橫坐標，蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)為縱坐標在半對數(shù)坐標紙上做圖，得到一條標準曲線。4)測定蛋白質(zhì)樣品的分子量：根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標準曲線上查得該蛋白質(zhì)的分子量。六、實驗報告要求認真書寫實驗報告，做好實驗現(xiàn)象的描述、實驗結(jié)果的分析，要求記錄清楚，并對實驗方案提出改進的意見等。七、實驗中的注意事項1Acr和Bis有神經(jīng)毒性，可經(jīng)皮膚、呼吸道等吸收，故操作時要注意保護。2.固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED（四甲基乙二胺）要在注膠前

38、再加入,否則凝結(jié)無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡.3.注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下沉?xí)r會發(fā)生擴散。為避免邊緣效應(yīng),最好選用中部的孔注樣.八、思考題1聚丙烯酰胺盤狀凝膠電泳的幾個不連續(xù)性是什么？2電泳后上下槽緩沖液可否混合后再使用？為什么？3上樣緩沖液中加入甘油的作用是什么？4貯液配制及貯存應(yīng)注意什么？5過硫酸銨、7%乙酸和考馬斯亮藍在實驗中有什么作用？九、其它說明 無。實驗五 乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠實驗項目名稱：乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠實驗項目性質(zhì)：專業(yè)類所屬課程名稱： 生物技術(shù)原理試驗計劃學(xué)時： 4一、實驗的目的通過本實驗的學(xué)習(xí)，使學(xué)生了解乙醇沉析

39、法提取柑橘皮中的果膠的基本原理，掌握有機溶劑沉析法的基本操作技術(shù)。二、實驗內(nèi)容和要求教師講解實驗過程及注意事項后，4人一組，進行操作實驗。三、本實驗的基本原理和方法果膠是植物膠，屬于多糖類，存在于高等植物的葉、莖、根的細胞壁內(nèi)，與細胞彼此粘合在一起，尤其是果實及葉的含量較多；也是一種親水的植物膠，能溶于20倍水中生成粘稠溶液，不溶于乙醇及一般有機溶劑，在酸性條件下穩(wěn)定。由于其水溶液在適當(dāng)?shù)臈l件下可以形成凝膠，具有良好的膠凝化和乳化作用，因此可用于制造果醬、果凍或膠狀食物，也可用作食品添加劑、微生物培養(yǎng)基及保護劑等。果膠因其酯化度不同，可分為高酯果膠和低酯果膠。采用的原料和提取方法不同可得到不同

40、酯化度的果膠。以柑橘皮為原料生產(chǎn)的為高酯果膠（向日葵果膠其酯化度為30，是低酯果膠）。柑橘皮中果膠含量很高，一般為515左右。大部分以果膠質(zhì)形式存在，果膠質(zhì)不溶于水，但用稀酸可將其水解為可溶性果膠，利用多糖類物質(zhì)在乙醇中的溶解度的不同，加入一定量乙醇使其沉析，就可使果膠從溶液中析出，經(jīng)分離、干燥即得果膠純品。四、實驗主要儀器設(shè)備和材料1材料 新鮮柑橘皮50g2試劑 正磷酸、O.2molL鹽酸、焦磷酸鈉（又稱磷酸四鈉）、80乙醇、95乙醇、硅藻土粉末。3器具組織搗碎機、大燒杯（500mL）、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、搪瓷桶、酸度計、不銹鋼鍋、板框壓濾機。五、實驗方法、步驟1預(yù)處理 將柑橘皮在組織搗

41、碎機中搗碎置于不銹鋼鍋中，加入45倍的清水?dāng)嚢瑁訜岬?060浸泡10min，加熱至沸水中浸5min8min，以達到滅酶目的。滅酶后的柑橘皮在不斷攪動下用流動水沖洗至洗液接近無色為止。2提取 取處理好的柑橘皮置于搪瓷桶中，加入15倍量的自來水，再加入水量0.5的焦磷酸鈉。在不斷攪拌的條件下，用鹽酸和0.5磷酸的混合酸調(diào)節(jié)提取液的pH值，溫度控制在7582，調(diào)節(jié)提取液pH值至1.52.0時繼續(xù)攪拌提取20min，然后再調(diào)節(jié)pH值至2.5，繼續(xù)再提取20min。3分離 將提取液加入1的硅藻土作助濾劑，然后送入板框壓濾機。過濾后得無色透明的果膠稀溶液，濾渣棄去。4濃縮 將過濾收集的濾液置于真空濃縮裝

42、置中，于75溫度下濃縮，直至濃縮到果膠濃度為4左右。5沉析 將濃縮液置于搪瓷桶中，并冷至室溫，然后乙醇以噴淋方式加至已濃縮好的果膠溶液中，乙醇含量控制在4050的范圍內(nèi)，不斷攪動。這時，果膠聚結(jié)成海綿狀析出。6分離 將果膠乙醇混合物經(jīng)12h靜置后，送入板框壓濾機過濾。收集濾餅(果膠)，然后用80乙醇溶液洗滌濾餅12次，再用95的乙醇洗滌12次。洗完后壓干。7干燥 將以上濾好的果膠置于真空干燥器中于55左右干燥，即得果膠純品。六、實驗報告要求認真書寫實驗報告，做好實驗現(xiàn)象的描述、實驗結(jié)果的分析，要求記錄清楚，并對實驗方案提出改進的意見等。七、實驗中的注意事項1提取溫度 溫度過高容易引起果膠解聚，

43、降低果膠膠凝能力。溫度過低，則會延長萃取時間，造成果膠過分脫脂，一般以7582為宜。2提取時間 時間短，提取不完全；時間過長，則會引起果膠降解，難以得到高質(zhì)量的果膠。提取時間以40min60min為宜。3提取的pH值 pH值高，獲得果膠的膠凝能力強，但果膠收率低，當(dāng)pH值大于3.5時，就很難得到果膠。pH值低，果膠收率提高，但質(zhì)量下降。在提取過程中，體系的pH值會發(fā)生變化，要經(jīng)常用試紙檢測溶液的pH值，要使之保持穩(wěn)定，以保證提取正常進行。4脫色及醇洗 滅酶后的柑橘皮水洗脫色及進行分離操作時助濾劑的使用都有一定的脫色作用。脫色處理要徹底及最后的高濃度乙醇洗滌果膠濾餅時要充分，否則影響所得果膠純品色澤及含量。八、思考題1柑橘皮預(yù)處理時為何要加熱至沸而滅酶？