蛋白質(zhì)吸附分離研究進展

1、蛋白質(zhì)吸附分離研究進展【摘要 】 本文主要說明蛋白質(zhì)的分子結(jié)構，總結(jié)近年來蛋白質(zhì)的吸附理論及分離技術研究成果?！娟P鍵詞】蛋白質(zhì)；吸附；分離；表面活性劑目前， 蛋白質(zhì)的吸附已成為一個非常重要而活躍的研究領域。隨著科技進步，使得新型分離技術的開發(fā)，需求迫切。另一方面，由于生物反應過程機理十分復雜，反應較難控制，反應液中雜質(zhì)含量多，目標產(chǎn)物含量低，也給純化分離帶來了很大困難。本文主要對蛋白質(zhì)的吸附及分離進行綜述。1 蛋白質(zhì)分子結(jié)構蛋白質(zhì)一般由20 種不同的氨基酸組成，氨基酸之間由肽鍵連接。肽鍵與一般的酰胺鍵一樣，由于酰胺氨上的孤對電子與相鄰厥基之間的共振相互作用（resonance interact

2、ion）表現(xiàn)出高穩(wěn)定性。肽鍵的實際結(jié)構是一個共振雜化體。由于氧原子離域形成了包括肽鍵的羰基0、默基C和酰胺N在內(nèi)的O-CNH軌道系統(tǒng)，從而使得肽鍵的C-N具有部分雙鍵的性質(zhì)而不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵的C、 0、 N、 H 和與之相鄰的兩個a 碳原子處于同一個平面，此剛性結(jié)構的平面就叫肽平面。肽鏈主鏈上的僅碳原子連接的兩個鍵c N 鍵和 C-C 鍵能夠自由旋轉(zhuǎn)。如果不考慮鍵長和鍵角的微小變化，多肽鏈的所有可能構象都能用P 和中這兩個二面角來描述。2蛋白質(zhì)吸附的理論分析2 1 蛋白質(zhì)吸附的理論由肽鏈結(jié)構可知，蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，根據(jù)所處溶液pH 不同表面凈電荷可正可負。研究認為，蛋白質(zhì)吸附過程中的相互

3、作用包括氫鍵、靜電和疏水等非共價的相互作用2 。 3種相互作用的本質(zhì)都與靜電作用相關。其中氫鍵的形成是由于電負性原子與氫形成的基團中 氫原子周圍分布的電子少，正電荷氫核與另一電負性強的原子之間產(chǎn)生靜電吸引，從而形成氫鍵。疏水相互作用又稱為非極性相互作用，發(fā)生于非極性基團之間，蛋白質(zhì)同時含極性和非極性的基團，當?shù)鞍踪|(zhì)處于水溶液中時，極性基團之間以及極性基團與水分子之間易發(fā)生靜電吸引而排開非極性水基團，因此疏水相互作用并非是疏水基團之間有吸引力的緣故， 而是非極性基團由于避開水的需要而被迫接近（ 8） 。 這些相互作用本身與小分子的吸附?jīng)]有差別。蛋白質(zhì)吸附的獨特性在于吸附的是大分子，以及吸附過程蛋

4、白質(zhì)可以發(fā)生各種物理 （ 如構象變化）和化學的變化。3 2 材料表面性質(zhì)對蛋白質(zhì)吸附的影響當?shù)鞍踪|(zhì)吸附在材料的表面，其構象和序列將發(fā)生變化，因此蛋白質(zhì)的構象和序列會影響蛋白質(zhì)的吸附行為。有研究認為，蛋白質(zhì)與材料表面的相互作用（包括靜電力、范德華力、氫鍵、疏水作用），使吸附的蛋白質(zhì)的構象發(fā)生變化而達到穩(wěn)定吸附的狀態(tài)（4） 。另外是平鋪式還是直立式吸附，在材料的表面也會影響蛋白質(zhì)的吸附量嶼（4） 。蛋白質(zhì)的吸附會引起其物理和化學性質(zhì)的變化。初始的吸附現(xiàn)象是瞬間的，這種瞬間的初始吸附會伴隨吸附層的結(jié)構重整及再組織化晗 。這種結(jié)構重整除了會降低系統(tǒng)的吉布斯自由能外，對于吸附層上的蛋白質(zhì)還會有變性或分子

5、展開的效應，這會使原本被包覆在內(nèi)部的疏水性氨基顯露出來。以不帶電的聚甲醛和牛血清蛋白進行研究，觀察到蛋白質(zhì)濃度升高時吸附量也相應升高，當 BSA 濃度達到0 6 g L 時得到最大吸附值（3mg m2）， 之后吸附量不再與蛋白質(zhì)濃度有關（ 5） 。 蛋白質(zhì)在等電點時具有最大吸附量，并且在等電點附近呈對稱分布（1）。造成此現(xiàn)象有 2個原因：蛋白質(zhì)于等電點時具有最小溶解度，此時所需的吸附能最低；靜電排斥力在等電點時最小。3蛋白質(zhì)與表面活性劑的相互作用和 “疏水蛋白質(zhì)是兩性多聚電解質(zhì)，它的肽鏈又因形成各種有序結(jié)構而形成區(qū)” ， 表現(xiàn)出一定的表面活性。它和表面活性劑的相互作用，主要包括電性和疏水性兩部

6、分，這就使它們相互作用比較復雜。用疏水柱在FPLC 儀上測定了一些蛋白的表面疏水性(2)。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的疏水性與表面性質(zhì)密切相關，而與蛋白質(zhì)的分子量、疏水殘基總數(shù)并不直接相關。從動力學和熱力學的角度對表面活性劑和蛋白質(zhì)的相互作用進行了探討，從理論上對表面活性劑和蛋白質(zhì)的相互作用進行了總結(jié)( 1 ) 。 這一領域的研究主要集中于3 個方面：表面活性劑一蛋白質(zhì)復合物結(jié)構的研究及蛋白質(zhì)結(jié)構的變化；表面活性劑一蛋白質(zhì)混合溶液的相行為；表面活性劑一蛋白質(zhì)混合溶液的界面吸附。用表面張力法研究了SDS 和肌酸激酶的相互作用|。在蛋白質(zhì)溶液中引入帶相反電荷的表面活性劑時，因電荷中和，使復合體的凈電量減少直至零，

7、并引入了一些疏水基，故復合體的水溶性下降，沉淀析出。當表面活性劑的量進一步增加時，因疏水吸附、表面活性劑大量吸附達1 49SDS g 蛋白質(zhì)，復合體帶凈電荷增加，故水溶性增加， 沉淀又復溶解。表面活性劑和蛋白質(zhì)的這種作用可能意味著表面活性劑與蛋白質(zhì)的相互作用有兩個比較明顯的作用階段：電性作用和疏水作用。4 1 蛋白質(zhì)與非離子表面活性劑相互作用早期的理論認為非離子型表面活性劑與蛋白質(zhì)問由于缺乏靜電引力而不能發(fā)生相互作用。 但近來的研究表明，非離子型表面活性劑與蛋白質(zhì)也存在相互作用，這種作用極大地影響吸附層的性質(zhì)，對乳液的穩(wěn)定性尤為重要。研究蛋白質(zhì)與非離子型表面活性劑在界面的吸附多采用LB 膜技術

8、和界面流變學研究方法。采用磺化聚苯乙烯乳膠膜作為表面，運用LB膜技術測定Tween20對B 酪蛋白的置換量及置換過程中吸附層的水化厚度12。研究表明，隨著 Tween20 質(zhì)量分數(shù)的增加，蛋白質(zhì)被置換下來，吸附層的水化厚度降低，Tween20 的加入降低了以蛋白質(zhì)為乳化劑的乳液的穩(wěn)定性。在總結(jié)大量實驗事實的基礎上提出了蛋白質(zhì)一表面活性劑混合體系界面吸附的2 種機理： 增溶機理。分散在表面的蛋白質(zhì)分子與水溶性的表面活性劑形成蛋白質(zhì)一表面活性劑復合物，使蛋白質(zhì)分子以復合物的形式進入水相。此時，表面活性劑與被吸附的蛋白質(zhì)有強烈的相互作用；置換機理。由于表面活性劑與表面的相面上分散的蛋白質(zhì)被表面活性劑

9、置換下來。此時，表面活性劑必須強烈地吸附于表面。一般離子型表面活性劑與蛋白質(zhì)混合體系是增溶機理，而非離子型表面活性劑與蛋白質(zhì)的混合體系主要是置換機理。Levitz 對具有長極性鏈非表面活性劑烷基苯酚聚乙烯已二醇(CNaPENp)的表面作用進行了研究并提出了相應的簡化了的熱力學模型，聚乙烯鏈(POE)比離子型表面活性劑的相互排斥力弱，吸附后的形態(tài)如同伸展的皇冠狀。磷脂和肺部的一種主要親水蛋白質(zhì)(sP-A) 的相互作用，發(fā)現(xiàn)了一種“花束”狀吸附結(jié)構。并用電鏡觀測了其微觀結(jié)構。吸附過程中添加二價離子(如鈣離子)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)和磷脂層的結(jié)構發(fā)生了改變。Ruso等研究了不同表面活性劑一蛋白質(zhì)比率下全氟表面

10、活性劑與溶菌酶的相互作用16I 。 動態(tài)光散射發(fā)現(xiàn)酶的構型基本保持不變，只有二級結(jié)構略微變化。氟原子的疏水性很強，但由于C-F 鍵 的 剛 性 ， 阻 礙 了 疏 水 相 互 作 用， 結(jié) 果 導 致 主 要 相 互 作 用 為靜 電 作 用 。 應 用Longrnuir-Blodgett 單層技術研究4 種表面活性助沉降劑(它們的疏水基團相同)固定化脂肪酶，在一定表面壓力下用表面活性劑單層包裹脂肪酶(6) 。復合物的訂一A(A 為分子 ilia) 曲線趨勢與純表面活性劑有顯著不同，說明幾種表面活性劑與脂肪酶有相互作用。表面電勢能(u)可以用來表征單層分子電偶級的方位， U越大，偶極相互作用力

11、越顯著。5 2 蛋白質(zhì)吸附表面活性劑的測定方法通常，測定蛋白質(zhì)吸附表面活性劑的方法是“滲透平衡法”。但該法不僅復雜、耗時，而且不精確。李學剛等提出了采用陰、陽離子表頂活性劑互滴定和表面張力2 種簡單方法測定蛋白質(zhì)和表面活性劑的結(jié)合量，結(jié)果頗為近似，說明此 2 種方法在測定蛋白質(zhì)對表面活性劑吸附方面是可行的。界面剪切流變測定法可用來研究蛋白質(zhì)和低分子量表面活性劑之間的相互作用。NMR弛豫技術通過測定親水基a一碳笊代表面活性劑的旋轉(zhuǎn)弛豫速率表征蛋白質(zhì)一表面活性劑復合物的微觀結(jié)構。冷凍蝕刻電鏡(Cryo TEM) 可以在納米層次上直接觀察蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)一表面活性劑聚集體以及它們在稀溶液中的形貌變

12、化，是一種較NMR更定量的技術(7)。熒光技術作為種傳統(tǒng)的研究聚集體的方法，在研究蛋白質(zhì)結(jié)構變化方面又有新的發(fā)展。通過使激發(fā)波長和入射波長保持固定的波長間距，同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器， 可得到同步熒光光譜。根據(jù)發(fā)射光譜中波長的改變可判斷蛋白質(zhì)的構象的變化。同步熒光光譜技術已應用于藥物與蛋白質(zhì)的相互作用的研究中。將這種技術應用于蛋白質(zhì)與表面活性劑相互作用的研究中將會發(fā)揮重要的作用。4蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)的一個主要特點是分子大，而且不同種類的蛋白質(zhì)分子大小也不相等?？梢杂媚z過濾法、超濾法、 鹽析法、離心法及透析法等將蛋白質(zhì)與其它小分子物質(zhì)分離，也可將大小不同的蛋白質(zhì)進行分離。如顧有方等就是根據(jù)蛋白

13、質(zhì)的這種特性對血液中免疫球蛋白進行提取的。在室溫下，采用鹽析和等電點沉淀工藝分離除去提取液中的大豆蛋白質(zhì)腳。翁瑜等的雙向凝膠電泳比較3 種常用蛋白質(zhì)提取方法可以看出，雙向凝膠電泳的效果更好。仝向榮等通過離子交換、凝膠過濾、親和層析及反向高效液相色譜操作，提取了棒紋牛蛭體內(nèi)抗凝血蛋白。磁性高分子納米顆粒分離蛋白質(zhì)的原理主要分靜電吸附分離和親和分離?；陟o電吸附原理，Bucak 等人利用磷脂包裹的磁性納米顆粒的表面負電性選擇性分離出了帶有正電荷的蛋白質(zhì)。Liao 等制備了一種離子交換效率高、吸附解離速度快的核殼型(Fe。 OJPAA)磁性納米吸附介質(zhì)。利用該磁性納米吸附介質(zhì)，基于靜電吸附原理成功分

14、離了水相中的菠蘿蛋白酶。 同樣是利用這種磁性高分子納米顆?；谟H和技術實現(xiàn)了目標蛋白的選擇性分離，利用這種水溶性磁性納米顆粒表面的竣基，共價交聯(lián)IDA進而固定Cu2+,最后實現(xiàn)組氨酸標記蛋白的捕獲嘲。其實驗原理和Xu 研究小組的類似隗馴，只是將原來的無機磁核首先包被了 PAA,這樣磁性納米顆粒的磁響應特性增強，同時殼材料的保護也使得該顆粒能夠在生理環(huán)境中穩(wěn)定存在。利用N 一異丙基丙烯酰胺包裹磁性納米顆粒的熱敏性，通過改變溫度控制吸附或者解離，并成功的應用于牛血清白蛋白的分離。運用磁性納米微粒經(jīng)過表面修飾，連接 NH。集團作為分離器(NNPNH2),很容易從生物樣品中分離蛋白質(zhì)。筆者認為蛋白質(zhì)的

15、磁分離具有快速、高純度、高收率等優(yōu)點。5總結(jié)蛋白質(zhì)是構成生物體內(nèi)具有生物活性的高聚物分子，結(jié)構復雜。研究蛋白質(zhì)在界面上的吸附對于了解蛋白質(zhì)在界面上的吸附及分離提取蛋白質(zhì)具有重要意義。蛋白質(zhì)的吸附研究和分離工作仍是一項艱巨的任務，到目前為止，還沒有一個單獨的或一套現(xiàn)成的方法能把各種蛋白質(zhì)從復雜的混合物中吸附出來，但對任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一套適當?shù)姆蛛x程序來獲取高純度的制品純化。不過我們相信在今后科學工作者們一定能夠找出更多更好的方法來吸附分離蛋白質(zhì)，使得對蛋白質(zhì)有更深入的研究。參考文獻【 1 】沈同，王鏡巖生物化學( 上 ) ，第二版北京：高等教育出版社，1990 【 2】李學剛，董佳里，張光先表面張力法研究表面活性劑和肌酸激酶相互作用西南農(nóng)業(yè)大學學報，1997， 19：【 3】 李學剛， 董佳里 蛋白質(zhì)吸附表面活性劑的兩種測定法研究西南農(nóng)業(yè)大學學報，1997?！?4】顧有方，劉艷慧陳會良，等