《組織免疫熒光》word版

1、.免疫染色實驗方法和步驟     免疫染色(immunol staining)包括免疫熒光(immunol fluorescence)、免疫組化(immunol histochemistry)、免疫細胞化學(xué)(immunol cytochemistry)等，可以參考如下步驟進行操作。 1. 樣品準(zhǔn)備(Sample preparation)    對于貼壁細胞：     可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培養(yǎng)細胞，然后到預(yù)定時間時進行固定等后續(xù)操作。   

2、60; 也可以用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無菌的鑷子放置到6孔板內(nèi)，然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙醇。這時就可以種入細胞進行培養(yǎng)，待細胞貼在蓋玻片上生長良好后，即可進行固定等后續(xù)操作。    對于懸浮細胞：     把細胞先在固定液中固定，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上。然后就可以進行后續(xù)操作。如果細胞的粘附能力不佳，可以在載玻片上用PDL等物質(zhì)進行處理，以增強載玻片的粘附能力。    對于冷凍切片：    

3、; 切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續(xù)操作。    對于石蠟切片：     脫蠟：切片在二甲苯中脫蠟5分鐘，再換用新鮮的二甲苯脫蠟，共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鐘，兩次。90%乙醇5分鐘，兩次，70乙醇5分鐘，一次。蒸餾水5分鐘，兩次。     抗原修復(fù)：根據(jù)不同的抗原和抗體，可以選擇把切片放置在如下抗原修復(fù)液中，10mM檸檬酸鈉，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95加熱12分鐘，大約在30分鐘內(nèi)緩慢冷卻至室溫。

4、 2. 固定    可以使用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭毎蚯衅?，例如碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液(P0098)。固定完畢后，可以用免疫染色洗滌液(P0106)洗滌兩次，每次5分鐘。 3. 封閉(Blocking)     加入免疫染色封閉液(P0102)，封閉60分鐘。如果背景較高，可以4封閉過夜。     從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。     在整個免疫染色過程中我們推薦使用碧云天的側(cè)擺搖

5、床(ESHK02)，側(cè)向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋樣品。如果樣品比較容易脫落，也可以把所有的步驟放置在桌面上靜止進行，即封閉、抗體孵育、洗滌等步驟均不需搖動，但靜止操作時宜適當(dāng)延長作用時間或次數(shù)。4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)     參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用免疫染色一抗稀釋液(P0103)稀釋一抗。     用微型臺式真空泵(EVAC06/EVAC07)吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳

6、，可以4緩慢搖動孵育過夜。     回收一抗。加入免疫染色洗滌液， 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)     參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用免疫熒光染色二抗稀釋液(P0108)稀釋熒光標(biāo)記的二抗，或者用免疫染色(非熒光)二抗稀釋液(P0110)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或堿性磷酸酯酶(AP)標(biāo)記的二抗。辣根過

7、氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天訂購。     用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。     回收二抗。加入免疫染色洗滌液， 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高，可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。 6. 蛋白檢測(Detection of proteins)     對于免疫熒光染色，此時已經(jīng)可以直接到熒光顯微鏡下觀察。  

8、;   對于非免疫熒光染色可以選用DAB等適當(dāng)?shù)娘@色底物，或AB檢測體系等進行后續(xù)檢測。 7. 多重染色(Multiple staining)     如果進行的是免疫熒光染色，通常都可以進行多重染色。對于可以產(chǎn)生有色沉淀物的染色反應(yīng)，例如DAB染色，一般不適合再進行多重染色。    多重?zé)晒馊旧?    可使用紅色熒光、綠色熒光和藍色熒光進行三重?zé)晒馊旧?。例如用免疫熒光染色試劑?抗小鼠Cy3(P0193)進行紅色熒光染色，隨后可以用免疫熒光

9、染色試劑盒-抗兔FITC(P0186)進行綠色熒光染色，在完成上述兩種染色后可以使用Hoechst染色試劑盒(C0003)對細胞核進行染色，染色后為藍色熒光。     用HE染色進行復(fù)染：     免疫熒光染色后可以用蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(C0105)進行HE染色。免疫熒光染色步驟Immunofluorescence MethodFrozen Sections Snap frozen fresh tissues in liquid nitrogen or isopentane pre-cooled in l

10、iquid nitrogen, embedded in OCT compound in cryomolds. Store frozen blocks at - 80 º C. Cut 4-8 um thick cryostat sections and mount on superfrost plus slides or gelatin coated slides. Store slides at - 80 º C until needed. Before staining, warm slides at room temperature for 30 minutes an

11、d fix in ice cold acetone for 5 minutes. Air dry for 30 minutes. Wash in PBS     Paraffin Sections   Procedure for Immunofluorescence Staining   1.       Rinse Sections in washing buffer for 2x2 min. 2.       Primary Ant

12、ibody (沒有標(biāo)記一抗): incubate sections in primary antibody at appropriate dilution in primary antibody dilution buffer for 1 hour at room temperature or overnight. Noteo not rinse sections between serum block and primary antibody incubation. 3.       Rinse in washing buffer for 3x2 mi

13、n. 4     Secondary Antibody: incubate sections in biotinylated secondary antibody (生物素標(biāo)記的二抗) (1:500, Vector Labs) in secondary antibody dilution buffer for 30 minutes at room temperature. 5.       Rinse in washing buffer for 3x2 min. 6.     

14、0; Detection: incubate sections in FITC-Avidin D (1:500, Vector Labs) in PBS for 30 minutes at room temperature. Protecting slides from light starting from this step to the end by covering slides with aluminum foil or black box. 7.       Rinse in washing buffer for 3x2 min. 8.

15、60;      Counterstain with PI or DAPI if desired for 20-30 minutes at room temperature. 9.   Rinse in washing buffer for 3x2 min. 10.   Coverslip with Vector aqueous Anti-fade fluorescent mounting medium and seal with nail polish. 11.   Store slides in da

16、rk at 4 ºC.石蠟切片免疫組化染色步驟1、載玻片的處理：    抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：1.1 APES：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留2030秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應(yīng)注意組織要一步到位

17、，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留12分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。2、常用酶消化：2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%0.1%，消化時間為37、1040分鐘，主要用于細胞內(nèi)抗原的顯示。2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37

18、、30180分鐘，主要用于細胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。g/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鐘。m2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為2103、抗原熱修復(fù)：可根據(jù)實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)?？乖瓱嵝迯?fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 ± 0.1，如

19、因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調(diào)整。3.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，3H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在9298之間并持續(xù)1015分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據(jù)具體機型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻1020分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。3.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液

20、（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱56分鐘后），計時12分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達9298起開始計時1520分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻2030分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。4、免疫組化染色步驟：

21、（以美國ZYMED公司SP試劑盒為例）4.1石蠟切片脫蠟至水。4.2 3%H2O2室溫孵育510分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。4.3蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，(如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進行)。4.4 510正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37孵育12小時或4過夜。4.5 PBS沖洗，5分鐘×3次。4.6滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37孵育1030分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37或室溫孵育1030分鐘。4.7 PBS沖洗，5分鐘×3次。4.8滴加適當(dāng)

22、比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37孵育1030分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37或室溫孵育1030分鐘。4.9 PBS沖洗，5分鐘×3次。4.10顯色劑顯色（DAB或AEC）。4.11自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。 冰凍切片免疫組化染色步驟冰凍切片48mm，室溫放置30分鐘后，入4丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3過氧化氫孵育510分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2。下接免疫組化染色操作步驟。 細胞內(nèi)抗原的檢測-間接免疫熒光法     細胞內(nèi)抗原的檢測過程與細

23、胞表面抗原檢測過程基本一致，只是在與一抗孵育前，需要預(yù)先對細胞用非離子去污劑進行透化處理。【操作方法】（1）取已固定好的細胞爬片或甩片或經(jīng)過預(yù)處理的組織切片（石蠟或冰凍切片）；（2）用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的細胞2min（室溫），有些標(biāo)本可能需要長達15min，時間視抗原而定；（3）余下步驟接上述“細胞表面抗原的檢測-間接免疫熒光法”步驟（2）；【注意事項】（1）在使用前，一抗二抗均應(yīng)測試其合適的稀釋度。（2）多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的，標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后，應(yīng)再用去污劑處理，如果標(biāo)本在水溶液中浸泡的時間過長，則會使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。因此，應(yīng)避免固定后的標(biāo)

24、本在水溶液中浸泡的時間過長。（3）信號微弱的解決方法：提高一抗和二抗的濃度以增強敏感性 ，這必須測試各種濃度抗體的滴度；延長一抗和二抗的孵育時間。由于細胞染色時抗原吸附在固相載體上，抗原抗體結(jié)合時間較在溶液中長。孵育時間可因?qū)嶒炘O(shè)計作適當(dāng)調(diào)整，但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合。在以上兩點中，應(yīng)摸索出一個最正確條件以產(chǎn)生有效信號且保持良好的背景。這就需要反復(fù)試驗，因為每組抗體和抗原的情況會有所不同；改變檢測方法，用共聚焦顯微鏡觀察，可提高敏感性。（4）背景不好的解決方法    細胞樣本進行熒光染色時，背景問題主要來自兩個方面，即非特異性染色和特異性交叉反應(yīng)

25、。    非特異性吸附：非特異性吸附背景問題的產(chǎn)生與抗原抗體的特異性結(jié)合無關(guān)。即一抗或二抗與樣品相互作用而發(fā)生吸附，而不是與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。    *將所有抗體溶液或含蛋白的檢測試劑用100，000´g離心30min以去除蛋白聚合物。    *滴定一抗和所用的檢測試劑，以確定能夠產(chǎn)生合適信號的最低濃度。    *固定后，用飽和量并不被檢測試劑結(jié)合的非特異性抗體封閉樣品，有效的封閉液包括5%的與標(biāo)記二抗來源相同的同種血清、3%的BSA和3%的脫脂奶粉。 

26、   *用上述封閉液稀釋抗體和檢測試劑。    *固定后，在所有的緩沖液及洗滌液中加入2%吐溫-20。    *縮短一抗或標(biāo)記試劑的孵育時間。    *充分洗滌（延長洗滌時間，重復(fù)次數(shù)）。    *改變檢測方法。    特異性背景：造成特異性背景問題的原因有三種因素，即污染抗體所致假陽性、交叉反應(yīng)和樣品中含有能與Ig結(jié)合的蛋白質(zhì)。    *如用多克隆抗體，應(yīng)滴定抗體（假陽性）。 

27、0;  *如用多克隆抗體，親和純化特異性抗體（假陽性）。    *如用多克隆抗體，用適當(dāng)?shù)谋闻K粉吸收以阻抑假陽性。*換用其他抗體（交叉反應(yīng)及假陽性）。 細胞表面抗原的檢測-間接免疫熒光法 【試劑】（1）一抗和熒光標(biāo)記的二抗（2）固定液：如4%多聚甲醛、乙醇等。（3）洗滌液及抗體稀釋液(pH 7.4 PBS-Tween 20) 【操作方法】（1）取已固定好的細胞爬片或甩片或經(jīng)過預(yù)處理的組織切片（石蠟或冰凍切片）；（2）加入25ml一抗，完全蓋住蓋玻片，室溫孵育60min；注意不可使蓋玻片接觸培養(yǎng)板孔邊緣。每個檢測應(yīng)包括3組對照：與一

28、抗同一種屬、類型的無關(guān)抗體組，以檢測染色的特異性；未加一抗的對照組，以檢測二抗染色的背景；如果可能，用已知陽性樣品作為陽性對照組。（3）加入標(biāo)記FITC標(biāo)記的抗抗體（二抗）25ml，室溫孵育20min；標(biāo)記二抗在使用前，應(yīng)預(yù)試其合適的稀釋度；（4）用洗滌液洗3次，各5min；（5）在一干凈和作好標(biāo)記的載玻片上滴一滴封固液（約50ml）。用一尖頭鑷子將蓋玻片取出。將蓋玻片邊緣置于一干凈紙巾上蘸干液體。翻轉(zhuǎn)蓋玻片，使細胞面朝下，置于封固液上，慢慢放下蓋玻片，與載玻片相鄰與封固液的一端接觸，然后使蓋玻片置于封固液上，這樣可趕出氣泡。在觀察前空氣干燥30min；（6）在熒光顯微鏡下觀察、拍照。 經(jīng)典的

29、熒光抗體技術(shù)基本原理 (1)直接法直接法是熒光抗體技術(shù)最簡單、最基本的方法。它通過標(biāo)記抗體直接與相應(yīng)抗原（待檢抗原標(biāo)本）結(jié)合，來鑒定未知抗原。其優(yōu)點為：由于在反應(yīng)中只有兩種因子參與，結(jié)果判斷較簡單；特異性強，與其他抗原交叉染色較少；操作步驟少，方法簡便、省時。其缺點有；敏感性較差；一種標(biāo)記抗體只能鑒定一種抗原；不能用于鑒定未知抗體。 (2)間接法間接法是目前最常用的方法。首先用已知未標(biāo)記的抗體（第一抗體）與待檢抗原反應(yīng)或用未知抗體與已知抗原反應(yīng)，反應(yīng)一定時間后，洗去未結(jié)合的抗體，再與標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體（二抗）反應(yīng)。在第一步反應(yīng)中，若抗原抗體發(fā)生了反應(yīng)，則抗體被固定在標(biāo)本

30、上，那么第二步反應(yīng)中標(biāo)記的抗體（二抗）必然與第一步反應(yīng)形成的抗原抗體復(fù)合物中的抗體發(fā)生反應(yīng)，這樣就可以通過二抗的示蹤，對標(biāo)本中未知抗原或抗體進行鑒定。其優(yōu)點為；敏感性較高，是直接法的5-10倍；用一種標(biāo)記的抗體，就能與一種以上的相應(yīng)的抗體或抗原配合鑒定多種未知的抗原或抗體；既能鑒定未知抗原，又能鑒定未知抗體。其缺點有在反應(yīng)中有多種因子參與，容易產(chǎn)生非特異性染色，結(jié)果判斷有時較困難；操作步驟多，費時。 (3)雙標(biāo)記法    雙標(biāo)記法是用兩種熒光素（常用FITC和PE）分別標(biāo)記特異性不同的抗體，用于檢測同一標(biāo)本中的不同抗原。此法常用于細胞表面抗原和受體的研究

31、。 熒光抗體的質(zhì)量鑒定與保存     熒光抗體的質(zhì)量通常用抗體效價和結(jié)合比率（F/P比值）來表示。1、抗體效價：一般用瓊脂雙向擴散法測定。中央孔內(nèi)加抗原（1 mg/ml），抗體稀釋度在1:16-1:32呈陽性者較為理想。2、熒光素（F）與蛋白質(zhì)（P）結(jié)合比率（F/P比值）法   F/P比值系指熒光素與抗體蛋白的克分子比值，是標(biāo)記抗體質(zhì)量鑒定的重要指標(biāo)之一。該比值以1-2（抗球蛋白熒光抗體）或略高于2（抗菌熒光抗體）為宜，否則非特異性染色增強。若熒光素為TRITC，F(xiàn)/P比值在2.1-9.4之間均可用，但以數(shù)值較低者為佳?！驹噭浚?）

32、0.01mol/L pH7.2  PBS    （2）牛血清白蛋白（BSA）（3）0.025mol/L pH9.0 CB【方法】（1）將FITC用少量CB溶解后，再用0.01mol/L pH7.2  PBS 稀釋至100ml，作為原液；（2）用PBS配成0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0 10.0mg/ml，于490nm測定吸光度；（3）將BSA用凱氏定氮法測得蛋白含量，分別用0.01mol/L pH7.2  PBS配成0.1、0.2、0.31.5mg/ml，于280 nm測定吸光度；（4）以橫坐標(biāo)示FITC量（mg/

33、ml）或BSA含量（mg/ml），縱坐標(biāo)示相應(yīng)的吸光度，分別繪制FITC和BSA蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（5）于490nm或280nm分別測定標(biāo)記抗體的吸光度。查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出標(biāo)記物中熒光素量和抗體蛋白質(zhì)量；（6）計算F/P比值：                      OD495nmF/P比值=2.87×                OD280nm-0.35×OD495nm 如用TRITC標(biāo)記抗體，則按下式計算：           &