實驗一植物有絲分裂標本制備與染色體核型分析學時

1、 實驗一植物有絲分裂標本制備與染色體核型分析（6學時）（綜合實驗）實驗?zāi)康?掌握植物根尖染色體制片技術(shù)，觀察分析植物細胞有絲分裂各時期細胞及染色體形態(tài)、中期染色體的長短、臂比和隨體等形態(tài)特征，學習染色體核型分析的方法。第一部分 植物染色體壓片法一 實驗?zāi)康?. 學習并掌握根尖處理、染色、壓片及制片觀察的方法。2. 觀察有絲分裂各時期染色體的形態(tài)變化，了解有絲分裂全過程。二 實驗原理 高等植物有絲分裂主要發(fā)生在根尖、莖尖生長點及幼葉等器官的分生組織(分生區(qū))，其中根尖是最常用的材料：根尖取材容易，操作和鑒定也比其它器官與組織方便；實驗室內(nèi)采用種子萌發(fā)后所長出的新鮮幼嫩根尖，不受植物生長季節(jié)的影響

2、和限制，并且可以大量獲得；對于某些珍貴而又稀少的試驗材料，取用自然條件下生長植株的根尖，比取用莖尖、花器等對材料的傷害要小得多；采用實驗室內(nèi)種子發(fā)根，切取根尖后的種苗通常還可以進行正常種植，利于后續(xù)研究進行。 有絲分裂期在整個細胞周期中所占的時間相對較短，有絲分裂制片的主要目的是進行染色體鑒定，希望觀察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要對材料進行不同的預(yù)處理。 預(yù)處理主要通過抑制和破壞紡錘絲的形成來獲得更多的中期分裂相；同時，預(yù)處理還可改變細胞質(zhì)的粘度，促使染色體縮短和分散，便于壓片和觀察。常用的預(yù)處理有物理法、化學法、混合處理法等。 植物細胞的細胞壁對細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)起支撐和保護作用，分生

3、組織的細胞壁結(jié)構(gòu)將分生細胞結(jié)合成一個整體，因此在壓片之前需要采用適當方法軟化或部分分解細胞壁使細胞間易于分離，這一操作稱為解離。同時，解離也可適當清除部分細胞質(zhì)，使細胞質(zhì)背景趨于透明化，便于觀察染色體。常用的解離方法主要有酸解法和酶解法。酸解法：步驟簡便、容易掌握。根尖分生組織經(jīng)過酸解和壓片后，都呈單細胞，但大部分分裂細胞的染色體還包在細胞壁中間。酸解法廣泛用于染色體計數(shù)、核型分析和染色體畸變的觀察及相關(guān)分析。酶解法常用于染色體顯帶技術(shù)或姊妹染色單體交換研究。通過解離和壓片，分生細胞的原生質(zhì)體能夠從細胞壁里壓出，使染色體周圍不帶有細胞質(zhì)或僅有少量細胞質(zhì)，讓后續(xù)制片處理直接作用于染色體。 在普通

4、光學顯微鏡下觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)還需要對材料進行染色，通常采用染色體染色效果好而細胞質(zhì)著色少的堿性染料、酸性染料或孚爾根試劑染色。三 實驗材料蠶豆(Vicia faba, 2n=2x=12)根尖四 實驗器具、試劑 顯微鏡、恒溫箱、水浴鍋、計時器、培養(yǎng)皿、酒精燈、小燒杯、試管、載玻片、蓋玻片、鑷子、剪刀、刀片、解剖針、吸水紙、紗布、標簽、鉛筆、橡皮等常用工具。 0.1秋水仙堿，或飽和對二氯苯溶液，卡諾氏固定液，改良石炭酸品紅染液，冰乙酸，甲醇，無水乙醇，95乙醇，0.1升汞，mol/L鹽酸。五 實驗方法1發(fā)根 將蠶豆種子用0.1升汞消毒10min，經(jīng)流水沖洗，溫水浸種浸泡12d后，置25恒溫箱中發(fā)

5、根。待主根長到2cm左右時剪去主根（須根系植物的種子發(fā)出的主根不需剪掉），讓其充分長出側(cè)根。待側(cè)根長到1 2cm時，于適宜時間用蒸餾水洗凈，將水吸干，剪取根尖0.5 1cm進行預(yù)處理。為獲得盡可能多的分裂相，蠶豆根尖以上午910時剪取為宜。2預(yù)處理 將剪下的根尖立即放入0.1秋水仙堿或飽和對二氯苯水溶液中，以藥液浸沒根尖為度，處理34h。抑制和破壞紡錘絲的形成，使根尖細胞延遲其染色體的分離，增加中期分裂相，并使染色體分散于細胞中，以便觀察計數(shù)。3固定 材料經(jīng)預(yù)處理后，用流水沖洗，然后投入卡諾液（3份甲醇 1份冰乙酸，現(xiàn)配現(xiàn)用）中固定2024h，用95的乙醇洗兩次，轉(zhuǎn)入70乙醇中保存?zhèn)溆?。固定?/p>

6、目的是將材料迅速殺死，并使染色體形態(tài)、結(jié)構(gòu)盡可能保持不變和便于染色。4解離 常用酸解法：從70乙醇中取出固定好的根尖流水沖洗min吸水紙吸干放入盛有適量1 mol/L HCl，600.5水浴保溫的青霉素瓶中解離10min。5染色 改良石炭酸品紅染色： 解離后材料水洗3min并吸干，取1/2個根尖的乳白色分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加12滴染液，染色1015min，壓片。6壓片 在經(jīng)染色的材料上加一滴染液，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋片搓動)，使材料分散壓平，便于觀察。7鏡檢 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少數(shù)，因此壓片后要認真仔

7、細地進行鏡檢。先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細觀察、記數(shù)或拍照。調(diào)節(jié)可變光欄與反光鏡，使光線明暗合適，視場亮度適中。注意觀察有絲分裂全過程的染色體形態(tài)變化，找出染色體分散好的中期細胞進行染色體計數(shù)，對好的分裂圖像作上標記，以便再觀察。8封片保存 如制片標本符合要求，則把玻片放在干冰或冰箱中凍結(jié)，然后用刀片迅速把蓋玻片和載玻片分開，用電吹風吹干玻片，經(jīng)二甲苯透明后，滴中性樹膠，加蓋玻片封片，制成永久制片。 制作完成的制片標本要貼上標簽，注明材料名稱、可觀察到的有絲分裂典型時期、制片時間、制作者等信息。 間期在光學顯微鏡下，只看到均勻一致的細胞核及許多的絲狀染色質(zhì)。實質(zhì)上間期的核是處

8、于高度活躍的生理生化的代謝階段，正為細胞分裂準備條件。 前期核內(nèi)染色質(zhì)逐漸濃縮為細長而卷曲的染色體，每一染色體含有兩個染色單體，它們具有一個共同的著絲點；核仁和核膜逐漸模糊不明顯。 中期核仁、核膜逐漸消失，各染色體排列在赤道板上，紡錘絲與染色體的著絲點相連。染色體分散，易于鑒定形態(tài)、數(shù)目。 后期各染色體著絲點分裂為二，其每條染色單體也相應(yīng)地分開，并各自隨著紡錘絲的收縮而移向兩極，每極有一組染色體，數(shù)目和原來的相同。 末期： 分開在兩極的染色體各自組成新的細胞核，在細胞質(zhì)中央赤道板處形成新的細胞壁，使細胞分裂為二，形成二個子細胞。這時細胞進入分裂間期。 七 作業(yè)制作細胞有絲分裂前、中、后、末各期

9、的制片一張，中期應(yīng)能數(shù)清染色體數(shù)。貼上標簽，注明材料名稱，染色方法，制片日期和制作者姓名。2繪制所觀察到有絲分裂典型時期的染色體圖像，并簡要說明各時期染色體的行為變化和特征。八.注意事項1.酒精和解離液都要清洗干凈，并認真吸干，否則影響染色效果。 2.染色時間10分鐘是個參考時間，應(yīng)以實際染色效果判斷，不太長也不能太短。 3.鑷子敲打時，應(yīng)用力均勻，開始不要太重，避免細胞擠壓在一起。用力太輕不易使細胞處于同一平面，故應(yīng)適當控制敲打力度。 前期中期后期和末期第二部分 染色體核型分析一 實驗?zāi)康?學習和掌握核型分析的方法。2進一步了解染色體形態(tài)特征、在細胞分裂中的聯(lián)會形象以及染色體組、核型及染色體

10、數(shù)目、結(jié)構(gòu)變異與生物進化的關(guān)系。二 實驗原理 因為核型分析能明確識別各個染色體的特征，通過核型分析可以了解不同物種、同一物種不同亞種、或家畜不同品種甚至同一品種不同個體之間染色體結(jié)構(gòu)的差異，有助于基因定位及其它遺傳分析。三 實驗材料黑麥(Secale cereals, 2n=2x=14)根尖有絲分裂中期照片四 實驗器具、試劑不銹鋼尺，小剪刀，小鑷子，繪圖紙，粘劑，座標紙等。五 實驗方法1準備染色體標本的相片 將制作的細胞輪廓清楚，染色體集中而不重疊，主、次縊痕和隨體清晰，染色體長度適中而不彎曲的染色體標本，通過顯微攝影（或描繪）、沖洗、放大成染色體相片。2染色體測量 目測相片上每條染色體長度，

11、按長短順序初步編號，寫在每條染色體相片背面，用鋼尺逐個測量每條染色體長度（總長、長臂長、短臂長），換算出各條染色體的相對長度、臂比及著絲粒位置，有隨體的染色體，其隨體長度和次縊痕長度可計入全長，也可不計入，但必須加以說明。將測量和計算的數(shù)據(jù)分別記錄如表1-1和表1-2。用測微尺直接測量中期染色體長度：如果自己的制片很好，可以直接測量，然后統(tǒng)計計算。染色體總長度：整個染色體組全部染色體長度之和。相對長度：每一條染色體的長度與總?cè)旧w長度的百分比。臂率：長臂長度與短臂長度之比。臂比值著絲點位置表示符號1.00正中部著絲點M1.011.70中部著絲點區(qū)m1.713.0亞中部著絲點區(qū)sm3.017.0

12、0亞端部著絲點區(qū)st7.01端部著絲點區(qū)t端部著絲點T染色體臂比值、著絲點位置與染色體類型序號（條）實測長度mm序號（條）實測長度mm長臂短臂臂比長臂短臂臂比123456789101112 1314表1-1 核型分析實測記錄表表1-2 核型分析計算表 序 號（條）實測長度（mm）相對長度（）臂比染色體類 型長臂短臂全長長臂短臂全長1234567891011121314總 和3排列核型圖 按上述標準及計算結(jié)果，將照片上的染色體剪貼配對，重新編號。著絲粒排在同一水平線上，短臂在上，長臂在下。排列好后進行分析比較，確定其核型是否正常。若要準確細致分析，必須進一步運用染色體顯帶技術(shù)。4繪制核型模式圖 根據(jù)前面的計算結(jié)果和排列的核型圖，用繪圖紙和座標紙（座標紙放在繪圖紙下面）繪制核型模式圖。橫座標為染色體序號，縱座標為染色體（臂）的