葡萄球菌和鏈球菌的微生物學(xué)檢查

1、青 島 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 獸 醫(yī)微 生 物 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 題 目： 葡萄球菌和鏈球菌的分離鑒定 姓 名： 阿芳 學(xué) 院： 動(dòng)物科技學(xué)院 專 業(yè)： 動(dòng)物科學(xué) 班 級(jí)： 201X級(jí)X班 學(xué) 號(hào)： （201XXXXX） 指導(dǎo)教師： 任慧英 完成日期 2014年3月22日葡萄球菌和鏈球菌的分離鑒定摘要目的：對(duì)實(shí)驗(yàn)提供的A、B兩種細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定。主要方法：通過(guò)對(duì)細(xì)菌的分離培養(yǎng)，形態(tài)的觀察以及生化反應(yīng)的現(xiàn)象等方法進(jìn)行鑒定。關(guān)鍵詞：葡萄球菌；鏈球菌；分離鑒定引言 源自李一經(jīng).獸醫(yī)微生物學(xué)【M】.北京：高等教育出版社，2011，第五章 病原球菌。葡萄球菌是一群革蘭氏陽(yáng)性球菌，因常堆聚成葡萄串狀，故名。多數(shù)為

2、非致病菌，少數(shù)可導(dǎo)致疾病。葡萄球菌是最常見(jiàn)的化膿性球菌。無(wú)鞭毛，無(wú)莢膜，不產(chǎn)生芽胞，營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在含有血液和葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)更佳，需氧或兼性厭氧，少數(shù)專性厭氧。2838均能生長(zhǎng)，致病菌最適溫度為37，PH為4.59.8，最適為7.4。在瓊脂平板上形成圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，不透明的菌落。葡萄球菌在血瓊脂平板上形成的菌落較大，有的菌株菌落周圍形成明顯的完全透明溶血環(huán)（溶血），也有不發(fā)生溶血者。多數(shù)葡萄球菌能分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)生氣。致病性菌株能分解甘露醇。葡萄球菌在自然界中分布很廣，健康禽類的皮膚、羽毛、眼瞼、粘膜、腸道等都有葡萄球菌存在。

3、鏈球菌是化膿性球菌的另一類常見(jiàn)的細(xì)菌，常排列成鏈狀，無(wú)芽胞，無(wú)鞭毛，有菌毛樣結(jié)構(gòu)，革蘭氏染色陽(yáng)性。需氧或兼性厭氧，有些為厭氧菌。營(yíng)養(yǎng)要求較高。普通培養(yǎng)基中需加有血液、血清、葡萄糖等才能生長(zhǎng)。最適溫度37，最適PH7.47.6，血瓊脂平板上形成灰白色、有乳光、表面光滑、邊緣整齊、直徑0.50.75mm的細(xì)小菌落，不同菌株有不同溶血現(xiàn)象。根據(jù)在血瓊脂培養(yǎng)基上的溶血特征可分為三種不同類型：型溶血性鏈球菌又稱草綠色鏈球菌，菌落周圍出現(xiàn)草綠色溶血環(huán)，致病力弱。型溶血性鏈球菌產(chǎn)生強(qiáng)烈的溶血毒素，在血瓊脂培養(yǎng)基上，可使菌落周圍出現(xiàn)寬24毫米、界限分明、無(wú)色透明的溶血環(huán)，致病力強(qiáng)。型鏈球菌不溶血。能發(fā)酵簡(jiǎn)單的

4、糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。鏈球菌與葡萄球菌不同，不產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶。廣泛分布于自然界和人及動(dòng)物糞便和健康人鼻咽部，大多數(shù)不致病。1 材料與方法1.1 材料兩種未知的細(xì)菌分別為A菌、B菌。1.2培養(yǎng)基1.2.1普通瓊脂培養(yǎng)基的制作（1） 稱量：牛肉膏 1克、蛋白胨 2克、NaCl 1克、蒸餾水 200毫升于燒杯中。（2） 溶解：攪動(dòng)，加熱溶解。（3） 調(diào)節(jié)pH值：用NaOH溶液或HCl溶液來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)pH 為7.5。（4） 分裝：將制好的培養(yǎng)基分裝入燒瓶或試管內(nèi)，塞上瓶塞，用牛皮紙包扎瓶口。在121高壓蒸汽滅菌2030min即成。（5） 制作平板:將剛剛滅過(guò)菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培

5、養(yǎng)皿放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，點(diǎn)燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下瓶塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約倒入3mm厚度。鋪放培養(yǎng)基后放置15分鐘左右，待培養(yǎng)基凝固后，即可接種。1.2.2血瓊脂培養(yǎng)基的制作（1）兔子心臟取血：取一只兔子，找到心跳最快的位置，先用碘酒棉擦，再用酒精棉擦。垂直于兔子的心臟將已有0.5ml檸檬酸鈉溶液的一次性針管插入，抽取血液到5ml處。（2）制作血平板：按照1.2.1的方法制作普通瓊脂培養(yǎng)液，至不燙手后，向裝有普通瓊脂培養(yǎng)液的錐形瓶里注入3ml,混合均勻。將剛剛滅過(guò)菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，點(diǎn)燃酒精燈，右手托

6、起錐形瓶瓶底，左手拔下瓶塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約倒入3mm厚度。鋪放培養(yǎng)基后放置15分鐘左右，待培養(yǎng)基凝固后，即可接種。1.3細(xì)菌的劃線分離1.3.1平板的用途（1）供分離劃線；分離劃線的目的是為了得到單個(gè)菌落，以備進(jìn)一步鑒定。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)，得到更多的菌苔。1.3.2無(wú)菌操作 培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種環(huán)等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品菌）于培養(yǎng)基上。1.3.3分區(qū)劃線四個(gè)方向用接種環(huán)蛇形分區(qū)劃線，每劃一次之前都要先用酒精燈滅菌，且操作要在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。2 結(jié)果與分析2.1普通瓊脂平板2.1.1 A

7、、B菌的生長(zhǎng)情況如圖1圖12.1.2 A、B菌的生長(zhǎng)情況分析葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。鏈球菌營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良?？梢猿醪綌喽ˋ菌可能為鏈球菌，B均可能為葡萄球菌。2.2血瓊脂平板2.2.1 A、B菌的生長(zhǎng)情況如圖2圖22.2.2 A、B菌的生長(zhǎng)情況分析葡萄球菌在血瓊脂平板上形成的菌落較大，菌株菌落周圍形成明顯的完全透明溶血環(huán)（溶血），鏈球菌營(yíng)養(yǎng)要求較高，血瓊脂平板上形成灰白色、有乳光、表面光滑、邊緣整齊的細(xì)小菌落?？梢猿醪綌喽ˋ菌可能為鏈球菌，B均可能為葡萄球菌。2.3革蘭氏染色 胡桂學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程【M】.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006，革蘭氏染

8、色原理。 胡桂學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程【M】.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006，觸酶試驗(yàn)介紹。2.3.1基本原理革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色。革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌即被區(qū)別開(kāi)。2.3.2器材準(zhǔn)備（1）試劑：草酸銨結(jié)晶紫、革蘭氏碘溶液、乙醇（95%）、沙黃水溶液、生理鹽水、香柏油。（2）器材:載玻片、光學(xué)顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈等。2.3.3實(shí)驗(yàn)步驟載玻片固定。在無(wú)菌操作條件下，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌于干凈的已滴上生理鹽水的載玻片上涂布均勻，在火焰上稍加熱并使其粘附固定。用草酸銨結(jié)晶紫染12分鐘，水洗。再用革蘭氏碘溶液媒染13分鐘，水洗。 用乙醇（95%）脫色30秒，水洗。最后用沙黃

9、復(fù)染30秒，水洗。在光學(xué)顯微鏡下，用油鏡，鏡檢。2.3.4試驗(yàn)結(jié)果與分析葡萄球菌和鏈球菌均呈現(xiàn)藍(lán)紫色，都是革蘭氏陽(yáng)性菌。兩菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3圖32.4觸酶（H2O2）試驗(yàn)2.4.1基本原理葡萄球菌含有接觸酶（或H2O2），能催化H2O2產(chǎn)生水和初生態(tài)的氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡，而鏈球菌則不能產(chǎn)生氣泡。2.4.2器材準(zhǔn)備（1）試劑：3% H2O2，即1ml 30% H2O2 加入9ml 蒸餾水中即成。（2）器材:小試管、細(xì)玻棒、接種環(huán)、酒精燈等。2.4.3實(shí)驗(yàn)步驟取2ml 3%H2O2 ,加入干凈的小試管中，用細(xì)玻棒或接種環(huán)分別蘸取A、B兩種試驗(yàn)菌，插入H2O2液面下，若有氣泡產(chǎn)生著為陽(yáng)性。2

10、.4.4試驗(yàn)結(jié)果與分析A菌沒(méi)有產(chǎn)生氣泡，觸酶陽(yáng)性，而B(niǎo)菌產(chǎn)生氣泡。初步斷定A菌為鏈球菌，B菌為葡萄球菌。B菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4 圖42.5凝固酶試驗(yàn) 胡桂學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程【M】.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006，凝固酶試驗(yàn)介紹。2.5.1基本原理致病性葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶。是一種分泌至菌體外的游離凝固酶。作用類似凝血酶原物質(zhì)，可被血漿中的協(xié)同因子激活變?yōu)槟笜游镔|(zhì)，而使纖維蛋白原變成纖維蛋白，從而使血漿凝固，可用試管法測(cè)出。2.5.2器材準(zhǔn)備（1）試劑：0.5mL兔血漿、葡萄球菌。（2）器材:小試管、接種環(huán)、酒精燈。2.5.3實(shí)驗(yàn)步驟挑取細(xì)菌菌苔，混懸于1:4稀釋的0.5mL兔血漿與初步確

11、定為的金黃色葡萄球菌混合物中，充分混勻，置36±1°C培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時(shí)，查看結(jié)果。2.5.4試驗(yàn)結(jié)果與分析B菌出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時(shí)，內(nèi)容物不流動(dòng)，判為陽(yáng)性。B菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5圖52.6甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)2.6.1基本原理金黃色葡萄菌發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基變混濁，顏色由紫色變黃色，是為甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性。2.6.2器材準(zhǔn)備（1）試劑：甘露醇。（2）器材:甘露醇發(fā)酵管、接種環(huán)。2.6.3實(shí)驗(yàn)步驟無(wú)菌操作取初步確定為的金黃色葡萄球菌混合物接種于甘露醇發(fā)酵管，密封保存，37培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果。2.6.4試驗(yàn)結(jié)果與分析B菌使培養(yǎng)基變混濁，顏色由紫色變黃色，是為甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性。B菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6圖63 討論3.1兔子抽血量不夠由于實(shí)驗(yàn)兔子多次使用，產(chǎn)血量跟不上，導(dǎo)致在心臟跳動(dòng)最快的位置卻抽不出來(lái)血。3.2油鏡觀察不到或出現(xiàn)大片染色區(qū)域（1