實驗一蛋白質(zhì)的定量測定

1、實驗一 蛋白質(zhì)的定量測定Folin-酚試劑法(Lowry法)實驗室規(guī)則實驗室規(guī)則一、學(xué)生必須服從老師的指導(dǎo)，按照實驗?zāi)康?、要求和方法做好充分?zhǔn)備，一、學(xué)生必須服從老師的指導(dǎo)，按照實驗?zāi)康?、要求和方法做好充分?zhǔn)備，進(jìn)行實驗。進(jìn)行實驗。二、保持實驗室內(nèi)安靜、整潔，有秩序地進(jìn)行工作。二、保持實驗室內(nèi)安靜、整潔，有秩序地進(jìn)行工作。三、按照操作規(guī)程三、按照操作規(guī)程( (規(guī)則規(guī)則) )進(jìn)行實驗，正確地?fù)?jù)實將實驗數(shù)據(jù)等情況填寫在規(guī)進(jìn)行實驗，正確地?fù)?jù)實將實驗數(shù)據(jù)等情況填寫在規(guī)定的記錄本上。定的記錄本上。四、節(jié)約實驗材料和水電，按規(guī)定的數(shù)量取用原料和試劑。四、節(jié)約實驗材料和水電，按規(guī)定的數(shù)量取用原料和試劑。五、

2、愛護(hù)儀器設(shè)備，實驗完畢時，負(fù)責(zé)清洗干凈，并按規(guī)定要求存放原處；五、愛護(hù)儀器設(shè)備，實驗完畢時，負(fù)責(zé)清洗干凈，并按規(guī)定要求存放原處；儀器設(shè)備如有損壞，應(yīng)立即報告老師，同時向管理人員說明情況，按規(guī)定儀器設(shè)備如有損壞，應(yīng)立即報告老師，同時向管理人員說明情況，按規(guī)定辦好報損或賠償手續(xù)。辦好報損或賠償手續(xù)。六、實驗室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙，不準(zhǔn)帶入食品，不準(zhǔn)會客。六、實驗室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙，不準(zhǔn)帶入食品，不準(zhǔn)會客。七、不遵守實驗室規(guī)則的應(yīng)給予批評教育；對于嚴(yán)重違反操作規(guī)程并造成重七、不遵守實驗室規(guī)則的應(yīng)給予批評教育；對于嚴(yán)重違反操作規(guī)程并造成重大損失者，除賠償損失外，并視情節(jié)輕重給予必要的紀(jì)律處分，直至追究大損失者，除賠償

3、損失外，并視情節(jié)輕重給予必要的紀(jì)律處分，直至追究法律責(zé)任。法律責(zé)任。實驗報告的書寫實驗報告的書寫實驗報告是對實驗結(jié)果的科學(xué)總結(jié)。書寫實驗報告是培養(yǎng)和提實驗報告是對實驗結(jié)果的科學(xué)總結(jié)。書寫實驗報告是培養(yǎng)和提高文字表達(dá)能力高文字表達(dá)能力及概括綜合分析問題能力的重要訓(xùn)練方法。每次實驗后要求寫及概括綜合分析問題能力的重要訓(xùn)練方法。每次實驗后要求寫好實驗報告。實驗報告的書寫要求結(jié)構(gòu)完整、條理分明、文好實驗報告。實驗報告的書寫要求結(jié)構(gòu)完整、條理分明、文字簡煉、書寫工整、措詞推理符合科學(xué)性、邏輯性。具體格字簡煉、書寫工整、措詞推理符合科學(xué)性、邏輯性。具體格式如下：式如下： 1 1實驗名稱實驗名稱 姓名姓名

4、學(xué)號學(xué)號 班級班級2 2目的要求目的要求 3. 3. 原理原理4. 4. 主要試劑和儀器主要試劑和儀器5 5操作方法：操作方法：6 6實驗結(jié)果：是實驗報告的重要部分，一般要列出經(jīng)過歸納實驗結(jié)果：是實驗報告的重要部分，一般要列出經(jīng)過歸納整理的結(jié)果，并將實驗數(shù)據(jù)列表說明，若為圖形資料，應(yīng)做整理的結(jié)果，并將實驗數(shù)據(jù)列表說明，若為圖形資料，應(yīng)做好標(biāo)記及剪貼。好標(biāo)記及剪貼。 7 7討論：要針對實驗中所觀察到的現(xiàn)象與結(jié)果而言，注意不討論：要針對實驗中所觀察到的現(xiàn)象與結(jié)果而言，注意不要離開實驗的實際去空談理論或照抄書本。要判斷結(jié)果是否要離開實驗的實際去空談理論或照抄書本。要判斷結(jié)果是否為預(yù)期的，屬于非預(yù)期的

5、，要認(rèn)真分析原因。為預(yù)期的，屬于非預(yù)期的，要認(rèn)真分析原因。 1學(xué)習(xí)Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定未知樣品中蛋白質(zhì)含量。一目的要求微量凱氏定氮法 含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則變成氨，氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。此過程通常稱為“消化”。強堿使硫酸銨分解游離出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此過量酸液中和的程度，計算樣品的含氮量。本法適用范圍0.2-1.0mg氮，相對誤差應(yīng)小于2%。蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)

6、具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在收高峰在280 nm280 nm波長處。紫外吸收法在蛋白質(zhì)含波長處。紫外吸收法在蛋白質(zhì)含量量20-10020-100 g/ml內(nèi)服從比爾定律。內(nèi)服從比爾定律。 在堿性條件下在堿性條件下, ,具有兩個以上肽鍵的物質(zhì)能與雙縮脲試劑具有兩個以上肽鍵的物質(zhì)能與雙縮脲試劑的銅離子（的銅離子（CuCu2+2+）作用，形成紫色絡(luò)合物（該物質(zhì)的分）作用，形成紫色絡(luò)合物（該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式見圖），顏色深淺與肽鍵的多少即蛋白質(zhì)含量子結(jié)構(gòu)式見圖），顏色深淺與肽鍵的多少即蛋白質(zhì)含量成正比。成正比。 由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)

7、相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。通?？捎么朔▉矶ㄐ澡b定蛋白質(zhì)的存在。通?？捎么朔▉矶ㄐ澡b定蛋白質(zhì)的存在。也可根據(jù)反應(yīng)生成顏色的深淺，在也可根據(jù)反應(yīng)生成顏色的深淺，在540nm540nm波長處進(jìn)行比色，波長處進(jìn)行比色，定量測定蛋白質(zhì)的濃度。定量測定蛋白質(zhì)的濃度。允許測定范圍為允許測定范圍為1 110 mg10 mg蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。除除-CO-NH-CO-NH-有此反應(yīng)外，（有此反應(yīng)外，（-CONH2-CONH2-）、（）、（-CH2-CH2-）、（）、（- -NH2-NH2-）、（）、（-CS-CS-NH2-CS-CS-NH2）等基

8、團亦有此反應(yīng)。）等基團亦有此反應(yīng)。 2021-12-23Biochemistry Experiments12可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5 g/ml，通常測定范圍是25250 g/ml 1 1 器材器材1 1 試管及試管架試管及試管架2 2 移液管移液管(5 (5、1 1、0.5ml)0.5ml)、移液槍（、移液槍（0.2ml,0.2ml,用于樣品蛋白質(zhì)）用于樣品蛋白質(zhì)）3 7223 722型分光光度計型分光光度計4 4 電熱恒溫水浴電熱恒溫水浴三 試劑與器材2 2 試劑試劑1 1 標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液：標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液：500g500gmlml的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液。的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液。 2 Fo1in2 Fo1

9、in酚試劑甲酚試劑甲 3 Fo1in3 Fo1in酚試劑乙酚試劑乙 4 4 血清：稀釋血清：稀釋100100倍。倍。 Folin-Folin-甲由下述四種溶液配制甲由下述四種溶液配制(1)4(1)4碳酸鈉溶液；碳酸鈉溶液；(2)0.2N(2)0.2N氫氧化鈉溶液；氫氧化鈉溶液；(3)1(3)1硫酸銅硫酸銅(CuS0(CuS04 45 H5 H2 20) 0)溶液；溶液；(4)2(4)2酒石酸鉀鈉溶液。酒石酸鉀鈉溶液。在使用前，將在使用前，將(1)(1)與與(2)(2)等體積混合配成碳酸鈉等體積混合配成碳酸鈉氫氧化鈉溶液，將氫氧化鈉溶液，將(3)(3)與與(4)(4)等體積混合配成硫酸銅等體積混

10、合配成硫酸銅酒石酸鉀鈉溶液。然后，將這兩種酒石酸鉀鈉溶液。然后，將這兩種溶液按溶液按50:150:1的比例混合，即為的比例混合，即為Fo1inFo1in酚試劑甲。該試劑只能用一酚試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效天，過期失效。 Folin-Folin-乙乙在在2000ml2000ml的磨口廻流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉的磨口廻流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉(Na2WO42 H20)100g(Na2WO42 H20)100g，鉬酸，鉬酸鈉鈉(Na2MoO42 H20)25g(Na2MoO42 H20)25g，蒸餾水，蒸餾水700ml700ml，8585磷酸磷酸50ml50ml和濃鹽酸和濃鹽酸100ml100ml，充分

11、混合后，以小火廻流，充分混合后，以小火廻流10h10h。再加入硫酸鋰。再加入硫酸鋰(LiSO4)150g(LiSO4)150g，蒸，蒸餾水餾水50ml50ml及數(shù)滴液體溴。然后，開口繼續(xù)沸騰及數(shù)滴液體溴。然后，開口繼續(xù)沸騰15min15min，以驅(qū)除過量的，以驅(qū)除過量的溴。冷卻后定容到溴。冷卻后定容到1000ml1000ml，過濾，濾液呈綠色。，過濾，濾液呈綠色。 反應(yīng)物反應(yīng)物 (ml)0（空白對（空白對照管）照管）12345蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液 (500g/ml)00.20.30.40.60.8蒸餾水蒸餾水 ml1.00.80.70.60.40.2Folin-酚甲酚甲ml5.05.0

12、5.05.05.05.0Folin-酚乙酚乙ml0.50.50.50.50.50.5A (640nm)蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度 (g/ml)030456090120混勻后混勻后3030度水浴鍋中放置度水浴鍋中放置10 min10 min取6支試管 加加FolinFolin乙后立即搖勻，室溫下放置乙后立即搖勻，室溫下放置3030分鐘后以分鐘后以0 0號試管為空白對照，在號試管為空白對照，在640nm640nm處比色處比色1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A A640640為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度= =標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液(mL)

13、(mL)標(biāo)準(zhǔn)液濃度（標(biāo)準(zhǔn)液濃度（500500g/mlg/ml）/1.0/1.0 取取2 2支試管，各加入一定量的血清稀釋液支試管，各加入一定量的血清稀釋液( (已經(jīng)稀已經(jīng)稀釋釋100100倍，其蛋白質(zhì)含量在酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍倍，其蛋白質(zhì)含量在酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)之內(nèi)) )，本實驗取，本實驗取0.2ml0.2ml血清稀釋液，再加入血清稀釋液，再加入0.8ml0.8ml蒸餾水使樣品體積達(dá)到蒸餾水使樣品體積達(dá)到lmllml。其他操作與。其他操作與“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”相同。相同。 2. 2.血清蛋白質(zhì)濃度的測定血清蛋白質(zhì)濃度的測定反應(yīng)物反應(yīng)物 (ml)0（空白對（空白對照管）照管）12血

14、清稀釋液血清稀釋液 (已經(jīng)稀已經(jīng)稀釋釋100倍倍)00.20.2蒸餾水蒸餾水 ml1.00.80.8Folin-酚甲酚甲ml5.05.05.0Folin-酚乙酚乙ml0.50.50.5A (640nm)蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度 (mg/L)0加加FolinFolin乙后乙后立即搖勻，立即搖勻，3030分鐘后以分鐘后以0 0號試管為空白對照，在號試管為空白對照，在640nm640nm處比色處比色3、數(shù)據(jù)處理1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A500為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用EXCEL繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、計算特測蛋白濃度：用待測蛋白質(zhì)的A500從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的蛋白含量，據(jù)實驗中所加入的待測蛋白質(zhì)的體積計