水稻轉(zhuǎn)基因試驗方法與步驟

1、一、實驗?zāi)康?.學習水稻組織培養(yǎng)的方法2.學習水稻轉(zhuǎn)基因的方法二、實驗原理目的基因克隆到雙元載體中， 雙元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌， 然后攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織，通過T-DNA插入，把我們的目的基因整合到水稻染色體上。歷史：農(nóng)桿菌感染受傷的植物產(chǎn)生冠痿瘤病，發(fā)現(xiàn)是由Ti質(zhì)粒引起，同時做雜交，發(fā)現(xiàn)只有T-DNA （transferred DNA ）這一部分被整合到植物染色體上了。三、試驗步驟：一、水稻愈傷組織的誘導(dǎo)（一） 以水稻幼胚為試材誘導(dǎo)愈傷組織1.消毒：取水稻未成熟種子（灌漿期），按以下步驟消毒：1）用自來水沖洗種子，去掉浮起的癟谷；2）將種子放入250ml無菌燒杯中（種子數(shù)量約占1/

2、3體積），用200ml 70%酒精消毒2分鐘；（在操凈工作臺上進行無菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸鈉（NaClO ）溶液，同時加數(shù)滴吐溫-20,浸泡90分鐘；4）倒去NaClO溶液，用無菌蒸儲水清洗種子4-5遍。2.誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無菌操作）水稻轉(zhuǎn)基因GF1）用鑲子夾住種子，在無菌濾紙上用鋼鉤擠出幼胚，置入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；2）操作完畢后封好培養(yǎng)皿（一般保鮮膜），在暗處適溫下（25-28 C）培養(yǎng)5 天;3）繼代培養(yǎng)。用鑲子剝下胚性愈傷組織（去掉芽及膜狀物），置入繼代培養(yǎng)基中（凸起面向上），暗處適溫下（25-28C）培養(yǎng)3 天。（二）以水稻成熟胚為試材誘導(dǎo)愈傷組織1.消毒：取

3、水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子，按以下步驟消毒：1）將種子放入100ml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒2分鐘；2）倒去酒精，加入100ml 20%次氯酸鈉（NaClO ）溶液，浸泡30分鐘；3）倒去次氯酸鈉溶液，用無菌蒸留水清洗種子4-5遍，最后一遍浸泡30分鐘。2.誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無菌操作）1）種子放在無菌濾紙上吸干，置入成就胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿12- 14顆；2）操作完畢用封口膜（MicroporeTMSurgical Tape）封好培養(yǎng)皿，在28 C光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3周；3）在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鑲子挑取自然分裂的胚性愈傷組織（淡黃色，致密呈球

4、狀），置入繼代培養(yǎng)基中，在28C光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)1周。（如不馬上用，需轉(zhuǎn)移至暗處，于22 C繼續(xù)培養(yǎng)1周）一、農(nóng)桿菌培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌單克隆或吸取所保藏的農(nóng)桿菌菌液100 M于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培養(yǎng)液中，28C, 250rpm振蕩培養(yǎng)20-36h至菌液OD600為0.8-1.0。二、共培養(yǎng)和抗性愈傷組織的選擇1.感菌與共培養(yǎng)：1）取培養(yǎng)好的菌液500 pl于1.5ml離心管中，4C, 4000rmp,離心2min ,去上清。用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD600的終濃度為0.01;2）將長到一定大小的水稻愈傷組

5、織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染5分鐘；3）將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上瀝干30-40分鐘；4）將愈傷組織置于共培上。25C暗培養(yǎng)2.5天。2.選擇：1）將愈傷組織取出，用無菌水清洗5-6次，其間需不停的振蕩。再用含500mg/l頭弛拉定（或頭孑包嚷脂鈉）的無菌水清洗12遍。最后置于無菌濾紙上瀝干2小時；2）將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含500mg/l頭孑包拉定（或頭孑包嚷脂鈉）和50mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進行第一輪選擇，28C，光照培養(yǎng)14天；3）將長有抗性愈傷的初始愈傷轉(zhuǎn)到含500mg/l頭孑包拉定（或頭孑包嚷脂鈉）和50mg/l潮霉素的培養(yǎng)基上進行第二輪選擇，28C,光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性

6、愈傷組織長出。三、抗性愈傷組織的預(yù)分化（可選）將新長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基中，25C，光照培養(yǎng)7天。四、抗性愈傷組織的誘導(dǎo)分化和生根挑取從同一愈傷來的顏色鮮黃的抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或塑料廣口瓶中（每皿或每瓶放置5-7顆），用封口膜封好，放入恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗（15-30天）。待苗長至1cm左右，放入生根培養(yǎng)基中壯苗注：以上一至五的操作步驟皆在無菌條件下進行。五、轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽轉(zhuǎn)基因苗從分化到移栽最短時間為兩個月左右。將苗根部和莖葉分化得較完好的試管挑出（苗長至試管頂部，就要及時開蓋），打開封口膜，加入適量蒸儲水或無菌水（防止培養(yǎng)基長菌），煉苗3天至一周左右，然后洗去瓊脂，移栽到溫室的土缽中生長，檢測。四、注意事項1.超凈臺在用之前要紫外滅菌半個小事，使用前用酒精噴壺噴灑酒精，再用棉球擦干凈臺面2.水稻轉(zhuǎn)基因