Real-timePCR

1、2011級級目錄四.熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（掌握）六.參照系統(tǒng)（熟悉）二.實時PCR的定義（掌握）三.DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)（掌握）一.實時PCR的簡介與發(fā)展歷程（了解）五.幾個概念（掌握）七.應(yīng)用、優(yōu)點、局限性（了解）實時PCR的簡介與發(fā)展歷程 1986年末年末 Russ Higuchi來到來到PCR的誕生地的誕生地Cetus公司工作公司工作 ，探，探討討“閉管閉管PCR”的可能的可能“溴化乙錠溴化乙錠”的使用，光導(dǎo)纖維的使用。的使用，光導(dǎo)纖維的使用。1991年年Cetus公司的公司的Holland等在等在Proc Natl Acad Sci U S A 上發(fā)表了上發(fā)表了TaqMan prob

2、es技術(shù)。技術(shù)。 1993年美國年美國Applied Biosystems, Division of Perkin-Elmer 的的Lee 等在等在Nucleic Acids Research雜志上雜志上發(fā)表了使用雙熒光標(biāo)記的實時熒發(fā)表了使用雙熒光標(biāo)記的實時熒光光PCR方法。方法。 1996年美國紐約公共衛(wèi)生研究年美國紐約公共衛(wèi)生研究所所(Public Health Research Institute) Tyagi和和Kramer在在Nat Biotechnol上發(fā)表了分子信標(biāo)上發(fā)表了分子信標(biāo)(Molecular beacons)方法。方法。實時實時PCR技術(shù)的概念技術(shù)的概念又稱熒光定量又稱

3、熒光定量PCRPCR（FQ-PCRFQ-PCR）技術(shù)，）技術(shù)，指能實時檢測指能實時檢測PCR擴增周期每個時間擴增周期每個時間點（通常事每個循環(huán)結(jié)束后）的熒光點（通常事每個循環(huán)結(jié)束后）的熒光強度，通過對反應(yīng)體系中熒光信號的強度，通過對反應(yīng)體系中熒光信號的檢測實現(xiàn)對檢測實現(xiàn)對PCR過程中產(chǎn)物量的過程中產(chǎn)物量的實時實時監(jiān)測監(jiān)測，并根據(jù)參照系統(tǒng)較為精確地計，并根據(jù)參照系統(tǒng)較為精確地計算出算出PCR的初始模板量。的初始模板量。熒光定量熒光定量PCR與常規(guī)與常規(guī)PCR的區(qū)別的區(qū)別常規(guī)常規(guī)PCR技術(shù)：技術(shù)： 對對PCR擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行定擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行定性及定量分析性及定量分析熒光定量熒光定量PCR

4、技術(shù)：技術(shù)： 對對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)的擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進行定量分析產(chǎn)物進行定量分析Real Time PCRReal Time PCR的原理的原理激激發(fā)發(fā)光光發(fā)發(fā)射射光光CtCt值值DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)原理：在原理：在PCRPCR反應(yīng)體系中，加入過反應(yīng)體系中，加入過量量SYBR GreenSYBR Green染料染料，SYBR SYBR GreenGreen染料選擇性地?fù)饺胫岭p鏈染料選擇性地?fù)饺胫岭p鏈DNADNA后，產(chǎn)生熒光信號，未摻入至后，產(chǎn)生熒光信號，未摻入至雙鏈雙鏈DNADNA中的中的SYBRSYBR染料分子不會染料分子不會發(fā)射任何熒光信號發(fā)射任何熒光信號熒光信號的增

5、加與熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步，產(chǎn)物的增加同步，即結(jié)合的熒光信號和即結(jié)合的熒光信號和DNA含量成正比。含量成正比。SYBR GreenSYBR Green染料染料簡介：簡介：SYBR Green I是一種結(jié)合于所有是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒結(jié)合后，熒光大大增強。光大大增強。SYBR Green染料原理視頻講解染料原理視頻講解特點：特點：高靈敏高靈敏：至少可檢出：至少可檢出20pg D

6、NA，高于，高于EB染色法染色法25-100倍。倍。信噪比高信噪比高：樣品熒光信號強，背景信：樣品熒光信號強，背景信號低。號低。操作簡單操作簡單：無須脫色或沖洗。：無須脫色或沖洗。適用范圍廣適用范圍廣：可適用于多種電泳分析。：可適用于多種電泳分析。使用方便使用方便：不影響其它修飾酶作用。：不影響其它修飾酶作用。經(jīng)濟經(jīng)濟：價格比銀染便宜。：價格比銀染便宜。SYBR GreenSYBR Green染料染料DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)的評價優(yōu)點優(yōu)點：成本較低，操作簡單，無需對引物：成本較低，操作簡單，無需對引物或探針進行預(yù)先特殊的熒光標(biāo)記，適用于或探針進行預(yù)先特殊的熒光標(biāo)記，適用于任何反應(yīng)體系任何反應(yīng)體系

7、缺點缺點：特異性弱，因為染料也會結(jié)合到非：特異性弱，因為染料也會結(jié)合到非特異性擴增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體特異性擴增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反應(yīng)體系中的熒光本底較高。中，使反應(yīng)體系中的熒光本底較高。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光共振能量轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個熒光熒光共振能量轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量

8、轉(zhuǎn)移，即性的能量轉(zhuǎn)移，即FRETFRET現(xiàn)象，使得供體現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強（敏化熒光）（敏化熒光） 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)）技術(shù)1.水解探針（水解探針（hydrolization probe )技術(shù)技術(shù)2.雜交探針雜交探針 (hybridization probe )技術(shù)技術(shù)3.分子信標(biāo)分子信標(biāo) (moclecular beacon )技術(shù)技術(shù)水解探針（水解探針（hydrolization probe )技術(shù)技術(shù)又稱又稱TaqMa

9、n probe 技術(shù)，反應(yīng)體系中有兩條引物和一條技術(shù)，反應(yīng)體系中有兩條引物和一條熒光素標(biāo)記的探針。熒光素標(biāo)記的探針。TaqMan探針為一寡核苷酸，探針為一寡核苷酸，5 端標(biāo)記一個端標(biāo)記一個報告基團報告基團R（report group）如：）如：6-羧基熒羧基熒光素（光素（FAM）3 端標(biāo)記一個端標(biāo)記一個淬滅基團淬滅基團Q（quencher group）如：）如：6-羧羧基基-四甲基羅丹明（四甲基羅丹明（TAMRA）QR5 Q3TaqMan probe 技術(shù)的原理動畫技術(shù)的原理動畫R RQ QReporterReporterQuencherQuencherR RQ QIntact probe -

10、 reporter Intact probe - reporter quenched by FRETquenched by FRETF FR RR RQ QDuring PCR, probe hybridizes During PCR, probe hybridizes to target sequenceto target sequenceR RQ QProbe is partially Probe is partially displaced during extensiondisplaced during extensionR RQ QProbe cleaved by 5- 3 nucl

11、ease Probe cleaved by 5- 3 nuclease activity of polymeraseactivity of polymeraseR RQ QFree reporter exhibits Free reporter exhibits unquenched fluorescenceunquenched fluorescence熒光信號的檢測在每一個循環(huán)的延伸過程中進行熒光信號的檢測在每一個循環(huán)的延伸過程中進行雜交探針雜交探針 (hybridization probe )技術(shù)技術(shù)雜交探針雜交探針是由兩條引物和是由兩條引物和兩個探針兩個探針組成。組成。探針探針A的的3端

12、標(biāo)以熒光素，作為熒光染料供體，探針端標(biāo)以熒光素，作為熒光染料供體，探針B的的5端標(biāo)以另一種熒光染料，作為熒光染料受體。端標(biāo)以另一種熒光染料，作為熒光染料受體。這兩個探針與靶序列互補時的位置應(yīng)頭尾排列，并且這兩個探針與靶序列互補時的位置應(yīng)頭尾排列，并且兩者相距僅間隔兩者相距僅間隔15個堿基。個堿基。15個堿基個堿基供體熒供體熒光基團光基團受體熒受體熒光基團光基團靶靶DNA靶靶DNA雜交探針雜交探針 (hybridization probe )技術(shù)原理技術(shù)原理原理：原理：擴增過程中，探針擴增過程中，探針與模板雜交時兩種染料互與模板雜交時兩種染料互相接近，兩探針能夠進行相接近，兩探針能夠進行熒光共振

13、能量的轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)熒光共振能量的轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移過程中，外來光源首先移過程中，外來光源首先刺激供體熒光染料，供體刺激供體熒光染料，供體便發(fā)光刺激附近的受體熒便發(fā)光刺激附近的受體熒光染料，使后者再發(fā)射出光染料，使后者再發(fā)射出具另一種波長的信號而被具另一種波長的信號而被檢測系統(tǒng)接收。由于受體檢測系統(tǒng)接收。由于受體熒光染料只有在兩個探針熒光染料只有在兩個探針都與模板雜交時才會被激都與模板雜交時才會被激發(fā)而發(fā)射熒光信號，所以發(fā)而發(fā)射熒光信號，所以對信號的檢測室在退火后對信號的檢測室在退火后進行。進行。分子信標(biāo)分子信標(biāo) (moclecular beacon )技術(shù)技術(shù)該技術(shù)事一種基于熒光能量轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)和堿基互補原則

14、建立的技該技術(shù)事一種基于熒光能量轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)和堿基互補原則建立的技術(shù)。分子信標(biāo)實際是一段熒光素標(biāo)記的寡核苷酸，結(jié)構(gòu)是有環(huán)術(shù)。分子信標(biāo)實際是一段熒光素標(biāo)記的寡核苷酸，結(jié)構(gòu)是有環(huán)狀區(qū)和柄區(qū)組成，狀區(qū)和柄區(qū)組成，5 端標(biāo)記報告基團端標(biāo)記報告基團R，3 端標(biāo)記淬滅基端標(biāo)記淬滅基團團Q在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀探針雜交到探針雜交到DNADNA模板模板光光發(fā)出熒光發(fā)出熒光報告基團報告基團DNA 模板模板環(huán)狀區(qū)環(huán)狀區(qū)光光 淬滅淬滅分子信標(biāo)技術(shù)的原理分子信標(biāo)技術(shù)的原理水解探針技術(shù)水解探針技術(shù)是目前病原體核酸檢測商品化是目前病原體核酸檢測商品化試劑中比較常用的技術(shù)如用于

15、乙肝病毒、丙試劑中比較常用的技術(shù)如用于乙肝病毒、丙肝病毒等的檢測肝病毒等的檢測分子信標(biāo)分子信標(biāo)廣泛用于基因突變的分析、活細(xì)胞廣泛用于基因突變的分析、活細(xì)胞內(nèi)核酸的動態(tài)檢測、內(nèi)核酸的動態(tài)檢測、DNA/RNA雜交的動力雜交的動力學(xué)研究和學(xué)研究和DNA/蛋白質(zhì)相互作用的研究等蛋白質(zhì)相互作用的研究等如何對起始模板定量分析？如何對起始模板定量分析？通過通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析那什么是那什么是Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線？值和標(biāo)準(zhǔn)曲線？基本概念基本概念概念概念1：標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)經(jīng)系列稀釋的并且已知含量的根據(jù)經(jīng)系列稀釋的并且已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)擴增后得出的一

16、條曲線。它的橫坐標(biāo)是標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)擴增后得出的一條曲線。它的橫坐標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)為準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)為Ct值。值。10105 5 10104 4 10 103 3 10 102 2 10 101 1 10 100 0概念概念2：基線基線：是指在：是指在PCR擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線光信號變化不大，接近一條直線熒光閾值熒光閾值： PCR反應(yīng)的前反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)差的的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)

17、差的10倍，即：倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 閾值循環(huán)數(shù)（閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）值）：處于擴增曲線和熒光本底基：處于擴增曲線和熒光本底基線的交叉點線的交叉點Threshold lineThreshold line C Ct t value value 外參照系統(tǒng)外參照系統(tǒng)外參照系統(tǒng)是用外參照系統(tǒng)是用標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過系列稀釋制備的經(jīng)過系列稀釋制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品1）靶基因的擴增片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒）靶基因的擴增片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒2）靶基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后）靶基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后3）逆轉(zhuǎn)錄）逆轉(zhuǎn)錄cDNA（組織或細(xì)胞作為檢測樣本時）（組織或細(xì)胞作為檢測樣本時）

18、4）病毒顆粒（病毒定量檢測時）病毒顆粒（病毒定量檢測時）基因組基因組DNADNAPCPCR R目的基因克目的基因克隆隆目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因質(zhì)質(zhì)粒粒外參照系統(tǒng)的缺點外參照系統(tǒng)的缺點 標(biāo)準(zhǔn)品生物線性范圍往往難以滿足所有被標(biāo)準(zhǔn)品生物線性范圍往往難以滿足所有被檢樣本的檢測需要檢樣本的檢測需要 無法控制標(biāo)準(zhǔn)品與被檢樣品之間擴增效率無法控制標(biāo)準(zhǔn)品與被檢樣品之間擴增效率的差異的差異 無法糾正被檢樣本的抽提速率和抽提質(zhì)量無法糾正被檢樣本的抽提速率和抽提質(zhì)量的差異（可以通過設(shè)置內(nèi)參照系統(tǒng)進行糾的差異（可以通過設(shè)置內(nèi)參照系統(tǒng)進行糾正）正）內(nèi)參照系統(tǒng)內(nèi)參照系統(tǒng)內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品實際上就是克隆一

19、段靶基因并人為引入地內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品實際上就是克隆一段靶基因并人為引入地突變序列突變序列內(nèi)參照設(shè)置是把一個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入被檢樣品中一起內(nèi)參照設(shè)置是把一個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入被檢樣品中一起抽提、一起擴增抽提、一起擴增優(yōu)點：內(nèi)參照系統(tǒng)避免了由于不同抽提效率導(dǎo)致的樣本優(yōu)點：內(nèi)參照系統(tǒng)避免了由于不同抽提效率導(dǎo)致的樣本間的差異，使結(jié)果的重復(fù)性更好定量更為準(zhǔn)確間的差異，使結(jié)果的重復(fù)性更好定量更為準(zhǔn)確缺點：該系統(tǒng)仍不能監(jiān)控內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因是否一缺點：該系統(tǒng)仍不能監(jiān)控內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因是否一致的擴增效率，因此還需要通過計算予以校正致的擴增效率，因此還需要通過計算予以校正Real Time PCR的用途的用途病毒及病原菌定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO