免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理

1、2021/4/272第一節(jié)第一節(jié) 體外免疫反應(yīng)的特點及影響因素體外免疫反應(yīng)的特點及影響因素(一一)抗原抗體反應(yīng)的特點抗原抗體反應(yīng)的特點 高度特異性高度特異性 特異性越強，親和力也越高；特異性越強，親和力也越高； 表面化學(xué)基團之間的可逆結(jié)合表面化學(xué)基團之間的可逆結(jié)合 抗原抗體結(jié)合除了空間抗原抗體結(jié)合除了空間結(jié)構(gòu)互補外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水結(jié)構(gòu)互補外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵等非共價結(jié)合。不如共價鍵穩(wěn)定，易受溫度、酸堿度鍵等非共價結(jié)合。不如共價鍵穩(wěn)定，易受溫度、酸堿度和離子強度的影響而解離，解離后抗原抗體仍具有原有和離子強度的影響而解離，解離后抗原抗體仍具有原有特性；

2、特性； 適宜的抗原抗體濃度和比例適宜的抗原抗體濃度和比例 決定抗原抗體結(jié)合后能否決定抗原抗體結(jié)合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)；出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)；1. 抗原抗體反應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)的2個階段個階段 第第1階段是抗原抗體特異性結(jié)階段是抗原抗體特異性結(jié)合，可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內(nèi)完成；第合，可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內(nèi)完成；第2階段是小的抗原階段是小的抗原抗體復(fù)合物靠正負電荷吸引形成較大復(fù)合物，所需時間抗體復(fù)合物靠正負電荷吸引形成較大復(fù)合物，所需時間從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。2021/4/273(二二)抗原抗體反應(yīng)的影響因素抗原抗體反應(yīng)的影響因素電解質(zhì)電解質(zhì) 抗原抗體等電點分別為抗原抗體等電點分別為p

3、H3-5和和pH5-6，在中性，在中性或弱堿性條件下表面帶有較多負電荷，適當(dāng)濃度的電解或弱堿性條件下表面帶有較多負電荷，適當(dāng)濃度的電解質(zhì)會使它們失去一部分負電荷而相互結(jié)合；質(zhì)會使它們失去一部分負電荷而相互結(jié)合；溫度溫度 通常為通常為37，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度可增加抗原與抗，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度可增加抗原與抗體分子的碰撞機會，但體分子的碰撞機會，但56以上可使抗原或抗體變性失以上可使抗原或抗體變性失活；活；1. 酸堿度酸堿度 抗原抗體反應(yīng)的最適抗原抗體反應(yīng)的最適pH值在值在6-8之間，之間，pH值過值過高或過低均可直接影響抗原抗體的理化性質(zhì)。當(dāng)高或過低均可直接影響抗原抗體的理化性質(zhì)。當(dāng)pH值接值接近等電

4、點時，抗原抗體多帶正負電荷相等，由于自身吸近等電點時，抗原抗體多帶正負電荷相等，由于自身吸引而出現(xiàn)凝集，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。引而出現(xiàn)凝集，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。2021/4/274第二節(jié)第二節(jié) 檢測抗原和抗體的體外實驗檢測抗原和抗體的體外實驗2021/4/275AbAg高親和力AbAg低親和力特異性特異性結(jié)合力的表示方法結(jié)合力的表示方法親和力和親合力親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab反應(yīng)的原理反應(yīng)的原理2021/4/276Ab 過剩Ag 過剩比例適當(dāng)，交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)Ag-Ab反應(yīng)的可見性反應(yīng)的可見性2021/4/2771.1.凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng) 1:2稀釋待測血清 1:4 1:8 1:1

5、6 細菌、細胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)Ab在電解質(zhì)存在的情況下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。玻片法試管法常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定常用于檢測抗體的滴度或效價，見于臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達氏反應(yīng)和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗。2021/4/278間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)Ab/Ag進行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫間接凝集反應(yīng)。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風(fēng)濕因子檢測。凝集反應(yīng)常用于溶血性疾病的診斷：+病人的病人的RBC體內(nèi)體內(nèi)anti-Rh由于抗體多屬于由于抗

6、體多屬于IgG，分子，分子量較小，抗體與紅細胞間的量較小，抗體與紅細胞間的結(jié)合力不能克服細胞間的排結(jié)合力不能克服細胞間的排斥力，不出現(xiàn)凝集斥力，不出現(xiàn)凝集+體外加入體外加入抗人抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫叫直接庫姆試驗直接庫姆試驗正常人正常人O型血型血的的Rh+的的RBC+患者血清內(nèi)的患者血清內(nèi)的游離游離anti-Rh+體外加入體外加入抗人抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫叫間接庫姆試驗間接庫姆試驗2021/4/2792.沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)AgAgAgAgAb in gel單向免疫擴散單向免疫擴散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴散雙向免疫擴散免疫比濁免疫比濁過量Ab Ab

7、 Ab Ab毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進行，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。鑒定多種抗原是完全相同、鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同部分相同或完全不同用于確定用于確定抗原濃度抗原濃度2021/4/2710沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫電泳免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合，在比例適宜處形成體結(jié)合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標準品相對比，置和形狀與標準品相對比，可分析樣品的成分及其性質(zhì)。可分析樣品的成分及其性質(zhì)。2021/4/27113.3

8、.免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù)免疫酶測定法免疫酶測定法免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)放射免疫測定法放射免疫測定法免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)2021/4/2712免疫酶測定法免疫酶測定法夾心法夾心法ELISA間接間接ELISABASELISA 利用生物利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)微粒捕獲酶免疫分析技術(shù) 將已知特異性抗體致敏的將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和免疫微粒與生物素、親和素、酶相結(jié)合，最后酶作素、酶相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過用于熒光底物發(fā)光，通過檢測熒光強度判斷未知抗檢測熒光強度判斷未知抗原的含量。原的含量。a）b）2021/4

9、/2713 免疫組化技術(shù)免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測2021/4/2714免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)2021/4/2715放射免疫測定放射免疫測定用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準確性高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測。常用的有131I、125I。化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。靈敏度高、簡便、可實現(xiàn)自動化分析。2021/4/2716免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)用膠體金顆粒標記Ab/Ag，以檢測未知Ag/Ab的方法。氯金酸在

10、還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。2021/4/2717免疫印跡法免疫印跡法-Western blotting2021/4/27184.4.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱為蛋白質(zhì)微列陣，指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微列陣。根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，可實現(xiàn)快速、準確、高通量的檢測。2021/4/2719第三節(jié)第三節(jié) 免疫細胞功能的檢測免疫細胞功能的檢測淋巴細胞及其淋巴細胞及其亞群的分離亞群的分離免疫細胞免疫細胞功能測定功能測定磁珠分磁珠分離法離法免疫吸附免疫吸附分

11、離法分離法流式細流式細胞術(shù)胞術(shù)肽肽MHC四聚四聚體技術(shù)體技術(shù)T細胞功細胞功能測定能測定B細胞功細胞功能測定能測定細胞因細胞因子檢測子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒細胞毒試驗試驗吞噬功吞噬功能測定能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學(xué)檢測法2021/4/2720外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞的分離稀釋血液淋巴細胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078) 離心單 個核細胞(PBMC，包括淋巴細胞、DC和NK)紅細胞和粒細胞血漿2021/4/2721磁珠分離法磁珠分離法免疫吸附分離

12、法免疫吸附分離法流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)肽肽MHC四聚體技術(shù)四聚體技術(shù)淋巴細胞及其亞群的分離淋巴細胞及其亞群的分離2021/4/2722免疫吸附分離法免疫吸附分離法加入淋巴細胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清2021/4/2723磁珠分離法磁珠分離法2021/4/2724流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)熒光抗體標記混合細胞噴嘴單細胞懸液5000-10000個/秒細胞分選器熒光檢測器2021/4/2725抗原肽抗原肽-MHC四聚體分離技術(shù)四聚體分離技術(shù)親和素親和素抗原肽抗原肽MHC I生物素生物素anti-CD8肽-四聚體肽特異性CD8TCD4T及B非肽特異性CD8T熒光素?zé)晒馑?02

13、1/4/2726二、免疫細胞功能的測定二、免疫細胞功能的測定T細胞功細胞功能測定能測定B細胞功細胞功能測定能測定細胞因細胞因子檢測子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒細胞毒試驗試驗吞噬功吞噬功能測定能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學(xué)檢測法2021/4/2727T細胞功細胞功能測定能測定T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測T細胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可通過以下三種方法檢測：形態(tài)計數(shù)法：活化細胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細胞核松散及出現(xiàn)較多核仁；3H-TdR或12

14、5I-UdR摻入法：3H-TdR能摻入到合成的DNA中，用液體閃爍儀檢測樣品的放射活性，特點是靈敏可靠，但須特殊儀器，易有放射性污染。1. MTT (四甲基偶氮唑鹽)比色法：外來抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，再用相同的抗原作皮試，可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)，T細胞活化并釋放多種細胞因子，產(chǎn)生以單個核細胞浸潤為主的炎癥，局部發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā)生，72h到達高峰。陽性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應(yīng)強烈的發(fā)生水腫甚至壞死。細胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細胞免疫低下者呈弱陽性或陰性反應(yīng)。常用于檢測某些微生物感染。2021/4/2728B細胞功細胞功能測定能測定抗體含量測定溶血空斑試驗可通過單項瓊脂擴散

15、法、ELISA、速率比濁法等測定標本中各類Ig的含量。綿羊紅細胞(SRB C)免疫動物4天后取出動物脾臟，在脾細胞懸液中含有抗SRBC的漿細胞脾細胞與SRBC在適量瓊脂糖液中混勻在抗體形成細胞周圍出現(xiàn)溶解的透明區(qū)，即溶血空斑。1個空斑區(qū)代表1個漿細胞通過記錄溶血空斑的數(shù)目可知抗原特異性B細胞的數(shù)目加入新鮮補體，倒入平皿中培養(yǎng)2021/4/2729細胞毒細胞毒試驗試驗51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法靶細胞被殺傷后，向體系中加入臺盼蘭，可進入膜破損的細胞內(nèi)，將細胞染成藍色。活細胞拒染而不著色。2021/4/2730凋亡細胞檢測法瓊脂糖電泳法正常細胞基因組DNA凋亡細胞TUNEL法在細胞中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和生物素標記的核苷酸TdT能在游離的DNA3端缺口連接標記的核苷酸加入親和素-酶復(fù)合物，在DNA斷裂處顯色流式細胞術(shù)Annexin VPI凋亡早期凋亡晚期壞死期2021/4/2731巨噬細胞吞噬試驗吞噬功吞噬功能測定能測定硝基藍四氮唑(NBT)試驗NBT在殺菌過程中產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞噬進細胞內(nèi)的NBT還原成不溶性藍黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。光鏡下計數(shù)NBT陽性細胞可反映PMN的殺傷功能。將待測m