PCR技術(shù)包含引物設(shè)計(jì)

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）原理：DNA的半保留復(fù)制時(shí)，雙鏈 DNA在多種酶的作用下可以變性解 鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配 對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)條件下，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制 DNA的變性和復(fù)性，弁設(shè)計(jì)引物做啟 動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù) 制。PCR類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序 列兩端互補(bǔ)的寡核甘酸引物。PCR由變性-退火（復(fù)性）-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94 c左右一定時(shí)間 后，使模板DNA雙鏈或

2、經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使 之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈 后，溫度降至4060 C左右，引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列 配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用 下，于72c左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿 基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”， 而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。PCR技術(shù)分類（常用）（1）反向PCR技術(shù)（

3、Inverse PCR, IPCR）:反向PCR是克隆已 知序列旁側(cè)序列的一種方法.主要原理是用一種在已知序列中 無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組 DNA.后酶切片段自身環(huán) 化.以環(huán)化的DNA作為模板，用一對(duì)與已知序列兩端特異性結(jié) 合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA片段，大小取決于上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板 DNA,再通過反向PCR獲得未知片 段。(2)錨定PCR技術(shù)(Anchored PCR, APCR):用酶法在一通用 引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3'-末端加上一段已知序列,然后以此序

4、列為 引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,稱為APCR。(3)不對(duì)稱PCR技術(shù)(asymmetric PCR):兩種引物濃度比例 相差較大的PCR技術(shù)稱不對(duì)稱PCR。在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的 引物濃度，常用50100 + 1比例。在最初的1015個(gè)循環(huán)中 主要產(chǎn)物還是雙鏈 DNA,但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后,高濃度引 物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生大量單鏈 DNAo(4)反轉(zhuǎn)錄 PCR技術(shù)(reverse transcription PCR, RT-PCR):當(dāng) 擴(kuò)增模板為RNA時(shí),需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為 cDNA才 能進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用非常廣泛,無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗(yàn)等 都經(jīng)常采用。(5)巢式

5、PCR技術(shù)(NEST-PCR):先用一對(duì)靶序列的外引物擴(kuò) 增以提高模板量,然后再用一對(duì)內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的PCR帶，此為巢式PCR若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式 PCR。為減少巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物 長些，且用量較少，同時(shí)在第一次PCR時(shí)采用較高的退火溫度而 第二次采用較低的退火溫度,這樣在第一次PCR時(shí)，由于較高退 火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合,故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)過 若干次循環(huán)，待外引物基本消耗盡,無需取出第一次PCR產(chǎn)物， 只需降低退火即可直接進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。這不僅減少操作步驟, 同時(shí)也降低了交叉污染的機(jī)會(huì)。這種PCR稱中途進(jìn)退式PCR,主要用于極少量

6、DNA模板的擴(kuò)增。(6)多重PCR技術(shù)(multiplex PCR):在同一反應(yīng)中用多組引物 同時(shí)擴(kuò)增幾種基因片段，如果基因的某一區(qū)段有缺失，則相應(yīng)的電 泳譜上這一區(qū)帶就會(huì)消失。主要用于同一病原體的分型及同時(shí) 檢測(cè)多種病原體、多個(gè)點(diǎn)突變的分子病的診斷。(7)重組PCR技術(shù)：重組 PCR技術(shù)是在兩個(gè) PCR擴(kuò)增體系中、 兩對(duì)引物分別由其中之一在其 5'-端和3'-端引物上帶上一段 互補(bǔ)的序列，混合兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)變性和復(fù)性，兩組PCR產(chǎn)物互補(bǔ)序列發(fā)生粘連,其中一條重組雜合鏈能在 PCR條件下發(fā)生 聚合延伸反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)包含兩個(gè)不同基因的雜合基因。(8)原位PCR技術(shù)：利用完

7、整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體 系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特 定的檢測(cè)手段來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石 蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行P CR擴(kuò)增，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi) 定位，適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列。(9)熒光定量實(shí)時(shí) PCR技術(shù)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使 DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升，最 終DNA擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計(jì)算，Y代表DNA片段擴(kuò)增后的 拷貝數(shù)，X表示平均每次的擴(kuò)增效率，n表示循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò) 增效率理論值為100%，但實(shí)際情況達(dá)不到，反應(yīng)初期靶序列 DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著 PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò) 增的D

8、NA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，此效應(yīng)稱平臺(tái)期，與DNA聚合酶數(shù)量和活性、PCR擴(kuò)增效率、非特異性產(chǎn)物的競爭等因素有關(guān)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分，短產(chǎn)物片段的長度 嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈 5'端之間，是需要擴(kuò)增的特定片 段。短、長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不同而形成的， 以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的 DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的， 3'端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一，這就是長產(chǎn)物片段。進(jìn)入 第二個(gè)反應(yīng)周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成 的

9、鏈(長產(chǎn)物片段)結(jié)合引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板 的5'端序列是固定的，故這次延伸的片段3'端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)、止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增的序列以 內(nèi)，形成長短一致的短產(chǎn)物片段。由于短產(chǎn)物片段是按指數(shù)倍 數(shù)增加，而長產(chǎn)物片段則以算術(shù)倍數(shù)增加，故可忽略不計(jì)，使 得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需再純化既可以保證足夠純的DNA片段供分析、監(jiān)測(cè)。反應(yīng)五要素一引物、模板、DNA聚合酶、四種dNTP、Mg2+(1)引物設(shè)計(jì)引物長度：15-30bp ,常用為20bp左右。引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至 10kb的片段。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，

10、G+C太少擴(kuò)增效果不 佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC最好隨機(jī)分布，引物 自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能超過 3個(gè)，一對(duì)引物間也不易多于四個(gè) 連續(xù)堿基的互補(bǔ)性?！疽锏腉C含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)：Tm=4 (G+C) +2 (A+T)避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是 3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條 帶。引物3'端為關(guān)鍵堿基，是 PCR延伸的起始端，不能進(jìn)行任 何修飾，也不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能，一般 3 '端也不能發(fā)生 錯(cuò)配，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。5'端無嚴(yán)格限制，只起限定 PCR產(chǎn)物長度的作用，對(duì)

11、 擴(kuò)增特異性影響不大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯 同源性。引物量： 每條引物的濃度 0.11umol或10100Pmol ,以 最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配 和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。（2） DNA聚合酶：目前有兩種 Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是 從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因 工程酶。催化一典型的 PCR反應(yīng)約需酶量0.5-2.5 U/50 ml ,濃 度過高

12、可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。（3） dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成 高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié) 到7.07.5,小量分裝，-20 C冰凍保存。多次凍融會(huì)使 dNTP 降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L ,尤其是注 意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃 度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低 又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。（4）模板（靶基因）核酸：模板核酸的量與純化程度，是 PCR成 敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用 SDS和蛋白酶K

13、來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上 的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，弁解離細(xì)胞 中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與 DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與 氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核 酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。（5） Mg2+濃度：Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的 影響，在一般的 PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L 時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反 應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反

14、應(yīng)產(chǎn)物減少。RT-PCR -是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò) 增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)?？俁NA提?。?70 C保存）Trizol 法：1、取組織100 mg于玻璃勻漿器中，加入 1ml Trizol冰上抽打勻 漿（邊勻漿邊暫停）2、移入1.5mlEP管中，顛倒混勻，室溫保存 5min3、加氯仿0.2ml （總體積的1/5）,振蕩混合，室溫放置 5min4、4C,離心 12000 rpm , 15min5、取上層液相（約400 "）移入一新1.5ml EP管中，加等體積異丙醇（約400 "）,振蕩混合，室溫保存10min6、4C,離心 12000 rpm

15、, 10min7、棄上清液，加1ml 75%無水乙醇（4c保存），振蕩混合8、4C,離心 7500 rpm , 5min9、棄上清液，室溫放置 20min（EP管倒置在濾紙上）使RNA沉 淀干燥（不能完全干燥）10、加20ul DEPC水至EP管中，在60c孵育3-5min（或手握3-5min）,使RNA充分溶解（可保存在液氮或低溫冰箱-70 C）測(cè)RNA濃度：走RNA變性電泳觀察18s、28s條帶，分光光度 計(jì)檢測(cè)260/280吸光度比值調(diào)零：750ul DEPC 水測(cè)量：745ul DEPC 水 + 5ul RNA總RNA濃度=OD260 X 40 X稀釋倍數(shù)（150倍）ug/ml=OD2

16、6040 X150<ug/ml=OD2606 ug/ul XA1/A2應(yīng)在1.8-2.0之間注意：提取RNA的質(zhì)量主要是要通過 260/280的比值看是不是 在2.0左右，當(dāng) OD260/OD280<1.8 時(shí)提示有蛋白或酚的污染，需要進(jìn)一步純化 RNA;還要跑膠看看28s、18s、5s的三條 帶是不是清晰，一般質(zhì)量好的 RNA, 28s:18s的亮度比例在2:1 左右，最后一條5s的應(yīng)該比較淡。逆轉(zhuǎn)錄RT （cDNA: 一周內(nèi)-20 C保存，長期-70 C保存）RT反應(yīng)體系：20ul體系第一步：約20分鐘RNA抽提物 5 lRadome 引物 2 lRNAsin0.5 以 11、

17、65 C 15 分鐘2、立即放入冰浴第二步：約2小時(shí)RNAsin 0.5以 110mM dNTP 1以 15 X RT緩沖液4以l25mM MgCl24以 lAMV3以 11、37 C 1.5 小時(shí)2、94 C 5-10 分鐘3、反應(yīng)物保存于-20 C或進(jìn)行PCR聚合酶鏈反應(yīng)PCR（產(chǎn)物-20 C保存）j! l315以ll112.5 以 l2.5 以 l5 jl ll30約5小時(shí)PCR反應(yīng)體系：100”體系約4.5小時(shí)25mM MgCl2210XPCR緩沖液5 "10mM dNTP110pmol/以l上游引物2.5 皿10pmol/ * 下游引物2.5 ji lcDNA模板2.5 以

18、lddH2O34Taq 酶0.5"1 l輕質(zhì)石蠟油50 *50”1、94 C 2分鐘，55 C 1分鐘，72 C 2分鐘 為第一個(gè)步1個(gè)循 環(huán)2、94 C 45秒，55 C 40秒，72 c 1分鐘為第二步30/40個(gè)循 環(huán)3、72 C 10 分鐘4、取出后4 c保存，5分鐘后-20 C保存或走電泳瓊脂糖凝膠電泳：約1.25小時(shí)1、配制0.5 X TBE電泳緩沖液 300 ml2、配制凝膠濃度1.7% （40ml 0.5 X TBE加0.68g膠），微波 爐中火2分鐘溶解膠，冷卻至 60 c加入澳乙錠2” （10mg/ml 的終濃度0.5以g/ml ）,充分混勻3、將溫?zé)岬哪z倒入已

19、置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進(jìn)行電泳4、力口樣8" PCR反應(yīng)產(chǎn)物+2”澳酚蘭，空一格加DNA marker5、電泳50-80V ,電場強(qiáng)度不宜高于 5V/cm6、在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠 成像系統(tǒng)拍照保存。電泳緩沖液（5 X TBE貯存液）：Tris 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。使用時(shí)，將 5XTBE 稀釋10倍成0.5 XTBE就可以在電泳時(shí)使用（工作濃度）。上樣緩沖液（6 X緩沖液，4 c保存）：0.25%澳酚藍(lán)、0.25%二 甲苯青FF、30%甘油瓊脂糖凝膠配制：（1.0%） 1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液， 微波爐加熱至沸騰（如果首次煮膠，一定要煮透，以不出現(xiàn)泡沫 為標(biāo)志），熔化的瓊脂物冷卻至 60 c時(shí)力口入10mg/ml澳化乙錠5”,充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在 室溫下放置30-45min（可以放入