pcR引物設計注意事項

1、ORF (Open reading frame )開放閱讀框是基因序列的一部分，包含一段可以編碼蛋白的堿基序列，不能被終止子打斷。CDS(coding sequence)序列是編碼序列，是用來編碼蛋白質的那段序列，是 mRNA勺一部分.通常外顯子指的是編碼蛋白序列.嚴格地說，外顯子是指保留在初級m RNA中不被剪切掉的區(qū)域，包5'非翻譯區(qū)(5' UTR)編碼序列和3'非翻譯區(qū)(3' UTR所以 mRNA勺外顯子的概念應該要大于 CDS序列的范疇何謂PCR? PCR引物設計時有哪些注意事項(1) 聚合酶鏈式反應簡稱 PCR (英文全稱：Polymerase Cha

2、in Reaction )。(2) PCR引物設計原則1設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。 引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基 本原理：引物長度GC含量，一般引物序列中 G+C含量一般為40%60% , 一對引物的GC含量和Tm值 應該協(xié)調。若是引物存在嚴重的 GC傾向或AT傾向則可以在引物 5'端加適量的 人、丁或6、 C尾巴。退火溫度退火溫度需要比解鏈溫度低5C,如果引物堿基數(shù)較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當減低退火溫度，是 DNA雙鏈結 合

3、。一對引物的退火溫度相差 4c6c不會影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物 的退火溫度是一樣的，可以在55 c75 c間變化。避免擴增模板的二級結構區(qū)域選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區(qū)域。用有關計算機軟件可以預測估計目的片段 的穩(wěn)定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能( G)小于58.6lkJ/mol 時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用 7-deaza- 2'-脫氧GTP取代dGTP對 擴增的成功是有幫助的。與靶DNA的錯配引物末端引物3'端是延伸開始的地方，因此要防止錯配就從這里開始。3'端不應超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在

4、 G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。3'端也不能有形成任何二級結構可能， 除在特殊的PCR (AS-PCR )反應中，引物 3'端不能發(fā)生錯配。如擴增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第 3位，因密碼子的第 3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。引物的二級結構引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結構，這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免3'端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應多于 4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 為了下一步操

5、作而產(chǎn)生的不完全匹配5'端對擴增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5' 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。額外的堿基或多或少會影響擴增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為了下一步的操作就要作出適當?shù)?犧牲”。PCR引物設計的黃金法則1 .引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內設計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在 NCBI上搜索不同 物種的同一基因，通過序列分析軟件(比如 DNAman )比對(Alignment),各 基因相

6、同的序列就是該基因的保守區(qū)。2 .引物長度一般在1530堿基之間。引物長度(primer length )常用的是18-27 bp，但不應大于38,因為過長會導 致其延伸溫度大于74 C,不適于Taq DNA聚合酶進行反應。3 .引物GC含量在40%60%之間，Tm值最好接近72 C。GC含量(composition )過高或過低都不利于引發(fā)反應。 上下游引物的GC含量 不能相差太大。另外，上下游引物的 Tm值(melting temperature )是寡核甘酸 的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核甘酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動 溫度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm= 4 (G+

7、C) +2 (A+T)估計引物 的Tm值，則有效引物的Tm為5580 C ,其Tm值最好接近72 c以使復性條 件最佳。4 .引物3'端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā) 生簡并，會影響擴增的特異性與效率。5 .引物3'端不能選擇A,最好選擇To引物3'端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時,即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3'端最好選擇To 6.堿基要隨機分布。引物序列在模板內應當

8、沒有相似性較高， 尤其是3'端相似性較高的序列，否則容 易導致錯誤引發(fā)(False priming )。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物 中四種堿基的分布最好是隨機的， 不要有聚喋吟或聚喀呢的存在。 尤其3'端不應 超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。7 .引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構( Hairpin )使引 物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。 引物自 身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免 3'端的互補重疊以防止引物

9、二聚體 (Dimer與Cross dimer)的形成。引物之間不能有連續(xù) 4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話， 應盡量使其4G值不要過高(應小于 4.5kcal/mol )。否則易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使 PCR 反應不能正常進行。8 .引物5'端和中間 G值應該相對較高，而3'端4G值較低。 G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對 穩(wěn)定性， G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應當選用 5'端和中間 G值相對較高， 而3'端4G值較低(絕對值不超過9)的引物。引物3'端的4G值過高，容易 在錯配

10、位點形成雙鏈結構并引發(fā) DNA聚合反應。(不同位置的 G值可以用 Oligo 6軟件進行分析)9 .引物的5'端可以修飾，而3'端不可修飾。引物的5'端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被 修飾而不影響擴增的特異性。引物 5'端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、 缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3'端開始的，不能進行任何修飾。3'端也不能有形成任何二級 結構可能。10 .擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單

11、鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好 避開二級結構區(qū)域。用有關軟件（比如 RNAstructure ）可以預測估計mRNA的 穩(wěn)定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G。）小于58.61 kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2 -脫氧GTP 取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。11 .引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行 BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。 有的模板本身條件比較困難，例 如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物； 用作克隆

12、目的 的PCR,因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只 能退而求其次，盡量去滿足條件。做Real Time時，用于SYBR Green I法時的一對引物與一般 PCR的引物，在引物 設計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設計的要求：12 避免重復堿基，尤其是G.2） Tm=58-60 度。3） GC=30-80%.4）3'端最后5個堿基內不能有多于2個的G或C.5）正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。6）PCR擴增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長至 300 bp） o7）引物的退火溫度要高，一般要在 60度以上；要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組 DNA污染影響的能力，即引物 應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)， 這樣可以更有效的不受基因組 DNA污染的影響。至于設計軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS 都應該可以的。做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工