抗氧化實驗方法

1、1還原力的測定樣品2ml加到2ml O.2mol/L 酸鹽緩沖液（pH6.6）和2ml 1%的鐵氟化鉀溶液的混臺液 中。混臺物在5（）匕保溫20min,然后在反應(yīng)混合物中加入2ml 10%的TCA,混臺后以300（）rpm 離心lOmin,取上清液2ml與2ml蒸憎水以及0.4ml 0.1%氯化鐵在反應(yīng)試管中反應(yīng)，lOmin 后測定其在700nm處的吸光值。吸光值越大表明還原力越強(qiáng)。注意：建議蛋白濃度以5mg/ml左右變化，例如2.5, 5之類變化。但具體情況應(yīng)根據(jù)吸 光值大小而定。O.2moi/L PH6.6的誡酸鹽緩沖液的配制見附表。鐵氟化鉀溶液應(yīng)盛裝在棕色瓶中。比色皿的用法：可見光（4（

2、）0nm）用玻璃比色皿（即沒有標(biāo)宇母或者標(biāo)G的比色皿），紫 外光時（4（）0nm）用石英比色皿（即標(biāo)Q宇比色皿）。2 DPPH自由墓清除活性的測定將1.5ml樣品液添加到1.5ml含0.1 mmol/LDPPH的95%乙醇中，混合,振蕩，在室溫下放W30min,然后在波長517nm處檢測（Ai）o清除率計算公式為：X100%空白為1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸憎水調(diào)零。式中：Ac對照為1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸憎水在517nm處的吸光值；Aj1.5ml樣品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm處的吸光值；Ai1.5ml樣品液加上1.5 ml DPPH溶液在

3、517nm處的吸光值；注意：逹議酶解液蛋白濃度以2mg/ml左右變化，如05,1,2,2.5之類變化，但是具體情況應(yīng) 視清除率而定，最終結(jié)果應(yīng)有清除率大于50%和小于50%的情況。DPPH樣品有毒，雷戴口軍和手套迸行操作。而且HPPH試劑很昂賁，用時注意節(jié)約。0.1m mol/L DPPH乙醇溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.0（）395gDPPH,用95%的乙醇溶液溶解并定 容到lOOmlo3在卵黃磷脂體系中抗氧化能力的測定以卵黃脂蛋白為底物的LPO模型反應(yīng)體系包括:體積比為1:25稀釋的卵黃懸液（卵黃用 等體積的pH7.45, O.lmoi/LPBS配成，使用前磁力攪拌10min）0.2 mL、一定

4、濃度的樣品溶液 O.lmL. 25m moll/LFcS（）4溶液0.2mL,用PBS緩沖液補足至2.0mLo對照管除不加樣液外其 他試劑同前。將上述2種試管同時直37°C恒溫水浴鍋中保溫培養(yǎng)lho取出后，加入 20%TCA0.5mL,靜萱lOmin后，與對照管于3500r/min商心lOmin,取2.0mL ±清液，分別 加入質(zhì)旻分教為0.8%硫代已比妥酸（TBA）溶液l.OmL,加塞于100°C水浴15min,取出冷卻。 空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下測定吸光度，樣品對卵黃脂蛋白LP（）的抑制率 表示為：SA（%）=（Ac 一 AS）/AC

5、X 100 式中:Ac不加樣品的吸光度As 一加入樣品的吸光度注意：卵黃溶液不用時應(yīng)放宣冰箱保存。酶解液蛋白濃度以5mg/ml左右調(diào)整，但具體應(yīng)視清除率大小而定，對醉解液蛋白濃度 進(jìn)行調(diào)整。硫代已比妥酸溶液雷放直于棕色瓶內(nèi)保存。并以50m mol/L NaOH溶液配制。再在50°C 水浴溶解。FuS（）4溶液應(yīng)以棕色瓶盛裝。4過氧化值的測定參照本食品學(xué)院林華娟等老師主編的食品分析實驗講義一書。5超氧陰離于自由基清除率的測定鄰苯三酚自氧化速率（V對照）：對照組和空白對照組加入4兇 蒸憎水（去商于水）和, 0.1 mol/LTris-HCl 緩沖溶液（pH8.2） 4.5ml,在 25&

6、#176;C 水浴 20min 后，樣品組加入 0.2ml （或 0.3ml） 3m Mol/L鄰苯三酚溶液，空白組以相同體積蒸僭水（去離于水）代替。農(nóng)勻后馬上在320nm 處測定吸光值。迅速混勻并開始計時，每隔30 si賣取吸光值,4 min后結(jié)束，以空白對照管調(diào) 零。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自實化速率V對照。（V對照在 0.05A/min-0.065A/min之間，否則應(yīng)調(diào)整鄰苯三酚加入長）樣品自氧化速率（V樣品）：樣品組和空白組均加入一定濃度的樣品溶液4ml, 0.1 mol/LTris-HCl 緩沖溶液（pH8.2） 4.5ml,在 25°C 水浴 20

7、min 后，樣品組加入 0.2ml （或 0.3ml） 3m Mol/L鄰苯三酚溶液，空白組以相同體積蒸憎水（去離于水）代替。虞勻后馬上在32（）nm 處測定吸光宣。迅速混勻并開始計時，每隔30 s讀取吸光值,4 min后結(jié)束，以空白管調(diào)零。 作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V樣品，按下式計算樣品 對超氧陰離于的抑制率：式中：抑制率（）=（V對照-V樣品）/V對照X 100V對照一對照組鄰苯三酚自氧化速率（AA/min）V樣品一樣品組鄰苯三酚自氧化速率（AA/min）動物實驗資料：摘自鷹嘴豆：抗氧化劑的抗氧化效杲受到多種因素的影響，只有在生物體內(nèi)具有抗氧化作 用的物質(zhì)才

8、能有效的清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，才能表現(xiàn)岀一定的生物活性。由于 體外抗氧化測定方法容易操作，周期短，因此評價一種物質(zhì)的抗氧化效果往往首 先采用體外抗氧化體系。但體外抗氧化體系往往與人體內(nèi)的生理環(huán)境相差太大， 許多研究結(jié)果表明采用體外方法評價有效的抗氧化劑進(jìn)入人體后卻表現(xiàn)不出應(yīng) 有的抗氧化效杲，因此抗氧化劑的抗氧化效杲在采用體外方法進(jìn)行初步評價后應(yīng) 采用動物實驗進(jìn)行體內(nèi)評價。人體在正常生理代謝過程中會產(chǎn)生少量的含氧自由基，如超氧陰離于、輕自 由基、過氧化氫等，這些自由基通過自然存在于體內(nèi)的抗氧化酶如超氧化物歧化 酶(SOD)、過氧化氫酶及抗氧化劑如抗壞血酸、維生素E組成的抗氧化系統(tǒng)來消 除。因此，

9、在正常狀態(tài)下，體內(nèi)自由基維持在一定水平并處于動態(tài)平衡中，正常 量的自由基對細(xì)胞的生長、分裂、解毒等具有有益的作用，在殺菌、免疫調(diào)節(jié)等 方面具有積極而重要的意義。然而，隨著增齡或在某些病理狀態(tài)下以及機(jī)體受到創(chuàng)傷時，體內(nèi)抗氧化酶活 性下降，從而導(dǎo)致機(jī)體代謝異常而驟然產(chǎn)生大量活性氧自由基；或由于機(jī)體抗氧 化物質(zhì)不足，使促氧化劑與抗氧化劑之間的平衡失常，致使自由基與機(jī)的一些生 物大分于，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)，生成大量氧化物或過氧化物，并 進(jìn)一步引起細(xì)胞死亡和組織損傷。業(yè)已證明，氧化損傷與衰老、腫瘤、糖尿病、 動脈硬化、神經(jīng)退行性病變以及人類免疫缺陷病毒(H1V)感染等均有密切關(guān)系。6半乳糖誘

10、導(dǎo)的亞急性衰老模型是按照衰老的代謝學(xué)說達(dá)立的,其機(jī)制與糖 代謝紊亂6、D-半乳糖醇中毒7和活性氧自由基過剩有關(guān)；眾多研究表明是生物 體內(nèi)含有半乳糖氧化酶，在催化D-半乳糖時可產(chǎn)生超氧陰離于自由基(。2 -)和 H2O2;如果長期人為地給予過量D-半乳糖，使機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生過量， 除了造成組織細(xì)胞直接損傷外，還導(dǎo)致抗氧化酶活力下降和過氧化產(chǎn)物積累，從 而表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的生化變化、免疫功能低下、基因表達(dá)與調(diào)控異常 細(xì)胞繁殖力下降及細(xì)胞退化性衰變等。有研究表明，6半乳糖可降低人胚肺二倍 體成纖維細(xì)胞(HES),從而使該細(xì)胞SOD活力降低和過氧化產(chǎn)物MDA增多，從 而起到加速細(xì)胞老化的作用。本文在前述章節(jié)已經(jīng)表明，鷹嘴豆蛋白酶解物具有體外抗氧化活性，但其在生物 體內(nèi)的作用效杲尚不清楚。為此本章采用D-半乳糖誘導(dǎo)