實驗設計方案書附技術(shù)路線

1、競賽設計及技術(shù)路線1. 研究目的本課題針對嚴重影響植物生長的安全因素軟腐害，在前期課題組研究植物生物防治和保護的基礎(chǔ)上，選取南方紅豆杉為研究材料，通過對南方紅豆杉內(nèi)生菌進行分離和純化，進一步通過拮抗實驗，探索其對半夏軟腐病菌、白菜軟腐病菌、番茄軟腐病菌等植物軟腐病菌的抑制效果，以期為半夏等中藥材、白菜等農(nóng)作物等植物軟腐病的生物防治提供優(yōu)良的菌株材料，從而為植物的綠色、安全、健康生長提供理論和技術(shù)支撐。2. 研究意義南方紅豆杉， 作為植物資源庫中的一株奇葩， 在材質(zhì)、藥用等方面起著非常重要的作用，鑒于其富產(chǎn)紫杉醇等多種藥用活性物質(zhì)的優(yōu)點， 本課題旨在將南方紅豆杉資源進一步優(yōu)化利用，深入挖掘其在抗

2、菌性、抗病性等方面的潛在價值。植物內(nèi)生菌， 作為一種新型微生物資源， 目前受到了廣泛的關(guān)注， 從內(nèi)生菌中尋找和發(fā)現(xiàn)新的活性化合物已成為國內(nèi)外研究的又一熱點， 近年來已發(fā)現(xiàn)了一些有醫(yī)用、農(nóng)用價值的菌株和化合物。 本文主要以南方紅豆杉為研究對象， 研究其內(nèi)生菌的多樣性， 并從中分離出對植物軟腐病菌具有抑制作用的拮抗菌株， 以進一步加強南方紅豆杉植株內(nèi)生菌的菌種研究，深化對植物軟腐病的防治作用研究，并為生物防治菌劑的開發(fā)和研制積累理論基礎(chǔ)。 為深入研究植物軟腐病的生物防治機理奠定基礎(chǔ)，為南方紅豆杉的資源應用開辟新的途徑。3. 實驗方案及技術(shù)路線3.1 實驗方案樣品采集南方紅豆杉植株采集時間為 201

3、2 年 5 月至 8 月, 采集于浙江省金華市婺城區(qū)南部山區(qū)，選取 1-3 塊代表性種植地，采用五點采樣法，采集南方紅豆杉整個植株，每點 5 株，分別采取南方紅豆杉的根、 莖、葉，存入牛皮紙帶， 做好記錄，立即帶回實驗室進行內(nèi)生菌的分離。樣品處理及消毒表面消毒取采集的南方紅豆杉植株根、莖、葉 ,用自來水充分沖洗后， 分裝在三個平板上，移至已滅好菌的超凈臺上，點燃酒精燈，用酒精擦拭手，首先將根用無菌水沖洗2次，再移至 70% 乙醇浸泡 20S，再用 2%次氯酸鈉浸泡 2min，無菌水沖洗 3次。保留最后兩次沖洗液， 取最后一次沖洗液適量于NA培養(yǎng)基中，進行涂布，完成后注明標記。取根的最后第二次沖

4、洗液將莖進行第一次沖洗，最后一次的沖洗液進行莖的第二次沖洗，依次進行上述操作。消毒效果驗證采用 2 種方法驗證樣品表面消毒效果： 組織印跡法：將以上消毒后的樣品，貼放于 NA培養(yǎng)基表面 5min 后，將培養(yǎng)皿于 30培養(yǎng) 3-5 天，觀察微生物生長情況。消毒液涂板法：將表面消毒的最后一次沖洗液涂布于 NA平板上，于 30 培養(yǎng) 3-5 天，觀察微生物生長情況。如果有菌生長，表明表面消毒不徹底。兩種檢測方法均證明以上樣品處理和消毒方法可行。內(nèi)生菌分離內(nèi)生細菌、放線菌分離： 樣品表面消毒、晾干后轉(zhuǎn)入加有 9mL無菌水無菌研缽中研磨勻漿， 取原液、稀釋 10 倍液和 100 倍液，然后分別涂于 NA

5、/高氏 1 號平板上 , 每個稀釋度設 3 個重復，平板倒置在 28的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)24h，放線菌培養(yǎng) 7-10d 。內(nèi)生真菌分離：在無菌操作臺上將消毒后的材料用無菌刀切成小塊， 莖、根：長度 2cm左右，等距離均勻放置于含有鏈霉素濃度為 30mg/L 的 PDA平板培養(yǎng)基上 (3-4 片/ 皿) ，設置 3 個重復，在 28的培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng) 5-7d 。細菌、真菌、放線菌的純化和保存挑取平板上不同表面形態(tài)的細菌、真菌、放線菌單菌落，分別在NA/PDA/高氏平板上劃線培養(yǎng)、 分離、純化，然后將純化的菌株轉(zhuǎn)接到相應的試管斜面培養(yǎng)基于 4保存。3.2 拮抗菌初篩拮抗細菌的平板初篩采用濾紙

6、片法和打孔法，拮抗真菌、放線菌采用對峙培養(yǎng)法。拮抗細菌篩選濾紙片法： 病原菌接種在牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基上，28培養(yǎng) 24h 后，用無菌水制成菌懸液備用。稀釋病原菌懸液濃度為 104 -10 5cfu/ml 的菌液，然后吸取 100 l 病原菌液涂 NA平板，在涂好的平板上勻稱的粘上直徑為 7mm的濾紙三片，每片濾紙上點接上 10 l 的供試菌（濃度約為 108 cfu/ml ），每個處理三個重復，然后置于 28的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)， 并記錄抑菌圈大小。拮抗真菌篩選病原菌及供試真菌的培養(yǎng)： 病原菌接種在牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基上，28培養(yǎng) 24h 后，用無菌水制成菌懸液備

7、用。 純化真菌接種到 PDA培養(yǎng)基平板上， 28培養(yǎng) 3-5d 。拮抗性測定：在 PDA平板上中央位置上點接上供試真菌，倒置于28培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 天, 然后在供試真菌的周圍涂布病原菌液（濃度為104-10 5cfu/ml ），最后倒置平板于 28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察抑菌帶的產(chǎn)生情況，并做相應記錄。拮抗放線菌篩選病原菌及供試放線菌的培養(yǎng): 病原菌接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，28培養(yǎng) 24h 后，用無菌水制成菌懸液備用。 純化放線菌接種到高氏一號培養(yǎng)基平板上， 28培養(yǎng) 5-7d ，制成菌餅 (7mm)備用。拮抗性測定: 首先在NA平板中央位置接入培養(yǎng)5-7天的放線菌菌餅，置于28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

8、3 天，然后在菌餅周圍均勻涂布培養(yǎng)24h的病原菌液（濃度為104-10 5cfu/ml），然后平板置于28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2天，觀察抑菌情況，并做相應記錄。3.2 技術(shù)路線選取南方紅豆杉根、莖、葉等新鮮組織采取不同的分離方法對南方紅豆杉內(nèi)生細菌、真菌、放線菌進行分離和純化調(diào)查、統(tǒng)計其中的細菌、放線菌、真菌的種類采取濾紙片法、對峙法等對分離的內(nèi)生菌進行植物軟腐病菌的拮抗活性鑒定比較不同內(nèi)生菌的拮抗活性整理實驗結(jié)果和分析4. 研究進度日 期內(nèi) 容6月20日-6 月30日方案設計與實驗器材材料的準備7月 1日-7 月30日采樣，內(nèi)生菌分離8月 1日-8 月30日拮抗菌的活性鑒定9月 1日-9 月15

9、日實驗數(shù)據(jù)整理，補充實驗9月16日-10 月 20日撰寫實驗報告，撰寫文章5. 預計成果本課題研究了南方紅豆杉內(nèi)生菌對影響植物安全生長的軟腐病的拮抗效果，試圖通過生物防治手段，實現(xiàn)對半夏、白菜、番茄等植物軟腐病的生長直到抑制作用。通過本實驗實現(xiàn)以下兩個目標：從南方紅豆杉中分離和純化細菌、真菌和放線菌， 通過統(tǒng)計分析南方紅豆杉內(nèi)生菌的菌群類型； 進一步確定以上分離的內(nèi)生菌對半夏軟腐病菌的拮抗效果；與已有研究進行比較分析。Soft rot,as a seriousimpact on plants( such as pinellia,tomato, cabbage )growth factors on the biological environment of safety, security andstabilityhas great destructiveness.The softrotby chemical means. Thisreview summariz