基因工程周巖基因工程載體

1、第四章 基因工程載體作為一個(gè)理想的載體，應(yīng)具備以下條件：作為一個(gè)理想的載體，應(yīng)具備以下條件： 載體：這種能與目的基因結(jié)合，且有完整的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能的 DNA 大分子稱之為載體（vector）。 （1）能夠在宿主細(xì)胞中存在并繁殖，有功能良好的復(fù)制子和啟動(dòng)子，使插入基因復(fù)制和表達(dá)；（2）具有多種限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，且切點(diǎn)是單一的，這樣可將多個(gè)外源 DNA 片段插入其中；（3）具有容易檢測(cè)的篩選標(biāo)記；（4）載體 DNA 的分子量適當(dāng)，可容納較大的外源DNA 片段，又可在受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增較多的拷貝；（5）在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，這樣可以使重組體可以穩(wěn)定傳代而不易丟失。 第一節(jié) 微生物基因工程載體克隆載體（cl

2、one vector）：主要是對(duì)目的基因克隆，建立DNA文庫和 cDNA 文庫，其上有復(fù)制子即可；表達(dá)載體（expression vector）：能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動(dòng)子；穿梭載體（shottle vector）：這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。一、質(zhì)粒載體1. 嚴(yán)緊型和松馳型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒：在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)較少，一般只有 1 13 3個(gè)。 松馳型質(zhì)粒：其拷貝數(shù)較多，一般 202060 60 個(gè)，多的可達(dá) 200200300 300 個(gè)。2 2、轉(zhuǎn)移型和非轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒轉(zhuǎn)移型，結(jié)合型（conjugative plasm

3、id）：是指一些質(zhì)粒在不同的菌株中可以相互轉(zhuǎn)移。 非轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒(non-conjugative plasmid)：則只能在一種寄主中生存 。3. 質(zhì)粒的不相容性和不親和群質(zhì)粒的不相容性：一般地，不同質(zhì)粒不能共處在一個(gè)細(xì)胞中，這種特性稱質(zhì)粒的不相容性，當(dāng)它們處在一起時(shí)，便有生存競(jìng)爭(zhēng)，結(jié)果一種質(zhì)粒繁殖，另一種逐漸被排斥，數(shù)目變少。 不親和群：彼此不相容的質(zhì)粒組成一個(gè)不親合群。 （二）質(zhì)粒的命名1. 人工組建的質(zhì)粒 人工組建的質(zhì)粒的第一個(gè)字母是質(zhì)粒英文名字（plasmid）的第一個(gè)字符 p，用小寫。p后有2個(gè)字母是大寫，表示質(zhì)粒的作者和實(shí)驗(yàn)室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號(hào)。例：pXYp109；pSC101

4、等 天然載體質(zhì)粒的第一個(gè)字母大寫，且質(zhì)粒符號(hào)用括號(hào)括起來。如（ColE1）；農(nóng)桿菌質(zhì)粒用p加Ti（Tumer inducing）或At（Agrobacterium tumefacions）表示，如 pTiC58。2. 2. 天然載體質(zhì)粒（三）常用質(zhì)粒載體 1. pSC101 圖2. pBR3222. pBR322 （1）組成它由三部分組成：來自 pSCl01 的四環(huán) 素抗性基因 Tetr來自 ColEl 的衍生物 pMBl 的松弛復(fù)制起點(diǎn) ori來自RSF2124的氨芐青霉素抗性基因Ampr。 （2 2）特點(diǎn)具有多個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。Tetr 中有BamH1切點(diǎn)（GGATCC）和Sal切

5、點(diǎn)（GAATTC），Ampr 中有 Pst切點(diǎn)（CTGCAG）。 利用 ColEl 的復(fù)制子，所以在細(xì)胞中是多拷貝的，可通過氯霉素使質(zhì)粒拷貝數(shù)進(jìn)一步擴(kuò)增。（3）重組克隆的 “插入失活”篩選方法pBR322外源基因插入在 Tetr中，基因型為Tets 、Ampr在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)；pBR322外源基因插入在Ampr中，基因型為Tetr 、Amps、在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，在在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長(zhǎng)； 而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)的是非重組型。這種在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源 DNA 片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫插入失活插入失活。 Amp rTet

6、 rTet rAmp sPstI. . . .涂布有Tet的培養(yǎng)基涂布有Amp的培養(yǎng)基. . .重組體的篩選外源基因的插入：.3、pUC系列質(zhì)粒載體 （1）特點(diǎn)具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷貝數(shù)。具有多克隆位點(diǎn)可用組化方法鑒別：可用組化方法鑒別：可通過插入失活法進(jìn)行篩選可通過插入失活法進(jìn)行篩選 含有一個(gè)來自于大腸桿菌的經(jīng)過加工的LacZ基因（LacZ），它編碼-半乳糖苷酶氨基端146個(gè)氨基酸 ，可以和-半乳糖苷酶缺陷型的大腸桿菌實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，即互補(bǔ) ，恢復(fù)分解乳糖的能力。 X-gal也是-半乳糖苷酶的一種底物，經(jīng)降解后可生成溴氯吲哚，使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。當(dāng)無-半乳糖苷酶時(shí)，X-

7、gal不被分解，菌落呈白色。 當(dāng)外源基因插入到pUC質(zhì)粒的LacZ基因內(nèi)部，則LacZLacZ基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重組體為藍(lán)色菌落。含Ampr抗性基因，可通過插入失活和顏色反應(yīng)進(jìn)行雙重篩選。lacZlacZN端 C端缺陷型大腸桿菌完整的-半乳糖苷酶（四）大腸桿菌中的表達(dá)載體表達(dá)載體應(yīng)含有： （1）強(qiáng)啟動(dòng)子（2）在啟動(dòng)子下游區(qū)和 ATG 上游區(qū)有一個(gè)好的SD序列。（3）在外源基因插入序列下游區(qū)要有一個(gè)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因有效轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。二、噬菌體載體 （一）噬菌體載體 1、噬菌體載體的特征 噬菌體顆粒中DNA

8、為線狀雙鏈 DNA 分子，全長(zhǎng) 48502 bp，兩端各有一段長(zhǎng)度為 12 個(gè)核苷酸的互補(bǔ)單鏈（粘端），稱為 cos 位點(diǎn)。噬菌體有 61 61 個(gè)基因，其中有 1/3 1/3 的區(qū)域是其裂解性生長(zhǎng)的非必需區(qū)，這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源 DNADNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是噬菌體可作為基因載體的依據(jù) 。 GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG環(huán)化作用2、噬菌體的缺陷與改造 基因組太大（49kb）； 酶 切 點(diǎn) 太 多 ， 它 有 5 個(gè) B a m H 1 位 點(diǎn)（GGATCC），6個(gè)Bg位點(diǎn)（AGATCT），5個(gè)EcoR位點(diǎn)（GAATTC）。 野生型只能接納

9、一定長(zhǎng)度的 DNA。若相當(dāng)于噬菌體的 75-105%，那么只能接納 49kb5%=2.45 kb的 DNA。 噬菌體的缺陷：噬菌體的改造 切去非必須區(qū)段，在切去的同時(shí)，加載目的基因（2.5kb或更大）； 去處太多的酶位點(diǎn)，每種酶只留1-2個(gè)切口； 增加標(biāo)記基因（remarke gene）。 3. 噬菌體的主要類型 （1）插入型載體 只有12種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn) 免疫功能失活大腸桿菌-半乳糖苷酶失活 （2）替換型載體 在其中央部位有一個(gè)可以被外源插入的 DNA 分子取代的 DNA 片段的克隆載體 。這是由于構(gòu)建此載體時(shí)，安排在中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因此，當(dāng)外源

10、 DNA 插入時(shí)，一對(duì)克隆位點(diǎn)之間的 DNA 片段便會(huì)被置換掉，從而有效提高了克隆外源 DNA 片段的能力。 （二）M13 噬菌體載體 M13 噬菌體屬絲狀噬菌體，其基因組為閉合環(huán)狀正鏈 ssDNA，6407 bp，其中 90% 的DNA都編碼蛋白質(zhì)，有 10 個(gè)基因，有兩個(gè)較長(zhǎng)的間隔區(qū)，是外源基因插入的部位。 M13 M13 噬菌體產(chǎn)生單雙鏈?zhǔn)删w產(chǎn)生單雙鏈 DNA DNA 的機(jī)制的機(jī)制1、以（+）鏈 DNA為摸板，合成互補(bǔ)（）鏈，該雙鏈稱復(fù)制型 DNA（RFDNA）。2、RFDNA 在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個(gè)細(xì)胞約 200 個(gè)拷貝。3 3、單鏈特異的DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合在（+

11、 +）鏈上，從而阻斷了其互補(bǔ)鏈，即（）鏈的合成，這樣，細(xì)胞就會(huì)不斷的合成（+ +）鏈 DNA DNA 。4 4、游離出來的（+ +）鏈 DNA DNA 先與基因V V的編碼產(chǎn)物形成特異的 DNA-DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，同時(shí)基因V V的蛋白質(zhì)從（+ +）DNA DNA 鏈上脫落下來，余下的 M13M13（+ +）鏈 DNA DNA 則是從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。 +- -+- -+- -+- -+- -+- -單鏈結(jié)合蛋白R(shí)F型DNA復(fù)制約200copy+以- -鏈DNA為模板合成+鏈DNA三、噬菌粒載體（科斯質(zhì)粒，cosmidco

12、smid ）1、構(gòu)建由質(zhì)粒和噬菌體的粘性末端構(gòu)建而成的。借用cos-（粘性尾巴）作字頭，質(zhì)粒的-mid作字尾，故稱 Cosmid，也叫粘粒載體。 2、特點(diǎn)（1） 有噬菌體的高效感染能力。（2 2）有質(zhì)粒的高效復(fù)制特性。（3 3）有更廣泛寄主。（4 4）有較大的容量。四、酵母菌載體 多數(shù)酵母中含有一種能獨(dú)立復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA，稱為 2質(zhì)粒，長(zhǎng)約 6.3 kb，有單一的復(fù)制起始點(diǎn)和一個(gè)自主復(fù)制功能區(qū)域（ARS片段）。 根據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制方式不同將它們分為：整合型、復(fù)制型、附加型和穩(wěn)定型等類型。 含有 E.coli 質(zhì)粒的復(fù)制起始序列，這樣在外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞前可先在大腸桿菌中擴(kuò)增。 含有酵母的篩

13、選標(biāo)記，這樣當(dāng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的酵母細(xì)胞后，可用來篩選重組體。 具有合適的供外源基因插入的限制酶切割位點(diǎn)。共同的特點(diǎn)：整合型：含有酵母的篩選標(biāo)記 ura3，但不具有酵母的復(fù)制起始點(diǎn)該質(zhì)粒 DNA DNA 以單拷貝形式穩(wěn)定遺傳，缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率較低（1 110 10 轉(zhuǎn)化子/g DNA/g DNA）. . 復(fù)制型：是酵母 DNA 片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的，插入片段含有酵母的篩選標(biāo)記 ura3 和 2u DNA 片段，一般以低拷貝數(shù)維持在酵母染色體之外。復(fù)制型載體對(duì)酶母的轉(zhuǎn)化率極高（102103 轉(zhuǎn)化子/g DNA），但是轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，容易丟失。 附加型：是在 pBR322 中插入酵母篩選標(biāo)記和

14、2uDNA 的 ARS 序列構(gòu)建成的。這種質(zhì)粒以附加體的形式存在于真核細(xì)胞中。附加型型載體對(duì)酵母具有很高的轉(zhuǎn)化活性（102103 轉(zhuǎn)化子/g DNA），且與復(fù)制型相比，穩(wěn)定性高，拷貝數(shù)也較高（25100分子/ 細(xì)胞）。 穩(wěn)定型：在附加型載體中再插入酵母著絲粒的一個(gè) DNA片段（CEN）。 第二節(jié) 植物基因工程載體 一、根癌農(nóng)桿菌及Ti質(zhì)粒 （一）根癌農(nóng)桿菌與冠癭瘤 根癌農(nóng)桿菌屬根瘤菌科農(nóng)桿菌屬，通過傷口可感染雙子葉植物，并在創(chuàng)傷部位使組織惡性增生而形成植物腫瘤，叫冠癭瘤（crown gall tumor）。 冠癭堿類植物激素 章魚堿胭脂堿農(nóng)桿堿（二）TiTi質(zhì)粒及 T-DNA T-DNA 的結(jié)

15、構(gòu)與功能 Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌非染色體的環(huán)狀雙鏈 DNA 分子，分子量為 90106150106 道爾頓，有160240 kb。 致病菌株37培養(yǎng)治愈菌株 （Ti 質(zhì)粒被消除）治愈菌株 與致病菌株接合致病菌株（重新獲得Ti質(zhì)粒）1. T-DNA 區(qū)胭脂堿型質(zhì)粒 T 區(qū)大小約 23 kb，單一序列插入植物核 DNA。 章魚堿型左區(qū)(TL-DNA)：長(zhǎng)約 13 kb，通常為單拷貝，有誘發(fā)和維持腫瘤的作用。右區(qū)(TR-DNA)：長(zhǎng)約 7kb，多拷貝含有參與冠癭堿生物合成的蛋白酶的編碼基因。圖章魚堿pTiAch5和胭脂堿pTiC58質(zhì)粒的遺傳圖共同區(qū)：T 區(qū)有控制腫瘤形態(tài)和編碼冠癭堿合成酶基因，實(shí)際上sh

16、i基因與生長(zhǎng)素合成有關(guān)。roi 基因與細(xì)胞分裂素合成有關(guān)，Ocs 是章魚堿合成酶基因，Agr 是編碼農(nóng)桿堿合成酶基因，章魚堿型與胭脂堿型的 T 區(qū)中上述基因分布不完全一致，但 90是相同的稱共同區(qū)。3 個(gè)同源區(qū)段，含有 6 個(gè)基因位點(diǎn)，是冠癭瘤形成所必需的，統(tǒng)稱“致癌基因” (oncogene，onc)。 非同源序列則編碼冠癭堿合成酶，在胭脂堿型中叫 Nos，章魚堿型酶叫 Ocs。 共同區(qū)已知 T-DNA 的兩側(cè)是被一對(duì)保守的 25 bp 的重復(fù)序列包圍著，而且在一系列不同的植物腫瘤DNA 中發(fā)現(xiàn)，T-DNA 的兩邊端點(diǎn)是位于這種同向重復(fù)序列的當(dāng)中或附近，這種同向重復(fù)序列實(shí)際上就是T-DNA

17、的邊緣區(qū)。右側(cè)邊緣區(qū)又叫 RB 序列，左側(cè)邊緣區(qū)又叫LB 序列。2、毒性Vir 區(qū)VirA、B、D和G為致瘤性，它們的突變型為非致病性。VirA、C、D 編碼專一核酸內(nèi)切酶蛋白，與 VirB 共同作用，與 T-DNA 遷移直接有關(guān)。VirC 部分決定寄主范圍VirE 與菌體感染過程有關(guān)Vir 區(qū)大約 35 kb，包含 6 個(gè)互補(bǔ)群，A、B、C、D、E、G。 3、代謝區(qū)Tra，T-DNA 轉(zhuǎn)移功能；Agr，農(nóng)桿堿代謝；Inc，不同類型質(zhì)粒代謝相容性；Occ 和 Noc，章魚堿和胭脂堿分解代謝。（三）農(nóng)桿菌對(duì)寄主的侵染和 T-DNA 的轉(zhuǎn)移 1、侵染過程2、T-DNA 的轉(zhuǎn)移（1）創(chuàng)傷植物細(xì)胞釋放

18、出可激活Ti質(zhì)粒 Vir 基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的蛋白因子；（2）VirA 和 VirD 蛋白因子進(jìn)一步激活其它的 Vir 基因進(jìn)行表達(dá)；（3）先在Ti質(zhì)粒右側(cè)邊緣區(qū)產(chǎn)生出頭一個(gè)單鏈缺口；（4）接著在 Ti 質(zhì)粒左側(cè)邊緣區(qū)產(chǎn)生出另一個(gè)單鏈缺口，結(jié)果釋放出的單鏈 T-DNA 分子便定向地轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞，并隨機(jī)整合到寄主染色體基因組上；（5）Ti 質(zhì)粒中移走的單鏈 T-DNA 區(qū)，通過 DNA 復(fù)制得到修復(fù)。（四）Ti質(zhì)粒作為植物基因工程的載體 1、可行性（1 1）將細(xì)菌轉(zhuǎn)座子 Tn7 插入胭脂堿合成酶基因（Nos）位置上，該Ti質(zhì)粒仍能實(shí)現(xiàn) T-DNA 轉(zhuǎn)移。 （2 2）用 Cat與 Nos Nos 和

19、Ocs Ocs 基因啟動(dòng)子拼接后，重組進(jìn)入 Ti 質(zhì)粒，Ti 質(zhì)粒感染植物，植物細(xì)胞中檢測(cè)到了 Cat 基因的酶的存在。 （1）轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞很難形成完整植株。（2）質(zhì)粒上分布著多個(gè)酶切位點(diǎn)，而不是單一切點(diǎn)，酶切后不易成環(huán)，給插入目的基因帶來困難。（3）Ti 質(zhì)粒只能在農(nóng)桿菌中復(fù)制、繁殖而擴(kuò)增，可農(nóng)桿菌對(duì)Ti的轉(zhuǎn)化率太低，只有 109107 左右 。2、存在缺陷（五）Ti質(zhì)粒的改造 1、去除致瘤基因Onc 由于影響植株再生的直接原因是 T-DNA 中的Onc 基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成為無毒的質(zhì)粒，記為 Onc，這個(gè)過程叫“卸甲”、 “繳械”或“解除武裝”，構(gòu)建的Onc載體叫“卸

20、甲載體” 。例：pGV38502、共整合質(zhì)粒 （1 1）首先構(gòu)建中間載體，如將大腸桿菌 pBR322質(zhì)粒帶上一段與 Ti 質(zhì)粒T區(qū)同源的一個(gè)片段，它在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中均能復(fù)制；（2 2）然后將目的基因插入該片段的適當(dāng)位置，這樣使目的基因兩端帶上了與 Ti 質(zhì)粒 T-DNA 同源的 DNA 序列；（3 3）然后再將該質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化或接合引入含有 Ti 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中。（4 4）引入的衍生質(zhì)粒和原細(xì)胞中 Ti 質(zhì)粒具同源性，因而可產(chǎn)生無性配對(duì)重組，通過交換，可將目的基因轉(zhuǎn)到 Ti 質(zhì)粒上，使之產(chǎn)生真正的具有外源基因的 Ti 質(zhì)粒，稱共整合質(zhì)粒。 3、雙元載體 “雙元載體” ，也稱反式載體，是指由兩

21、個(gè)分別含T-DNA 和 Vir 相容性Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)。 含有為 T-DNA 轉(zhuǎn)移所必須的 Vir 區(qū)的質(zhì)粒，另一個(gè)則是含有T-DNA區(qū)段的寄主范圍廣泛的DNA轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，后一種質(zhì)粒較小，可在大腸桿菌中復(fù)制，因而易操作，可用來插入外源基因。4、載體盒 所謂“載體盒” (Vector cassette) 是將植物的標(biāo)志基因、多插入位點(diǎn)、細(xì)菌標(biāo)志基因和質(zhì)粒的復(fù)制啟動(dòng)子位點(diǎn)等集于一身的質(zhì)粒系統(tǒng)，象一個(gè)集裝箱似的集合在一起。 二、Ri 質(zhì)粒載體 三、CaMV(花椰菜花葉病毒)載體系統(tǒng) Ri質(zhì)粒其結(jié)構(gòu)和功能與 Ti 十分相似。與Ti質(zhì)粒相比的優(yōu)點(diǎn)：可以構(gòu)建完整的 Onc+ 載體。花椰菜花葉病毒

22、 (caulimovirus，簡(jiǎn)稱 CaMV) 實(shí)際上是一個(gè)病毒群，已知有 12 個(gè)種，每個(gè)種的寄主范圍都很窄，不感染豆類和單子葉植株，它的主要寄主是蕓苔屬。 CaMV DNA 有兩個(gè)特別之點(diǎn)，一是在專一位點(diǎn)有不連續(xù)性，DNA 鏈上有一處到三處不連續(xù)；另一點(diǎn)是在電鏡下觀察到 DNA 大部分有盤繞結(jié)構(gòu)，看上去似超螺旋。1、互補(bǔ)載體系統(tǒng) 2 2、混合載體系統(tǒng) 缺陷性CaMV + + 輔助病毒分子 將CaMV DNA克隆到了Ti質(zhì)粒上，通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞，可產(chǎn)生典型的病毒感染癥狀。 3、CaMV35S啟動(dòng)子融合基因載體系統(tǒng) SalI Kmr SalISalITi質(zhì)粒T- DNA區(qū)SalI Kmr

23、 SalI混合載體構(gòu)建過程SalISalISalI四、脂質(zhì)體(liposomes)(liposomes)載體 （一）、脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種由脂雙分子層圍成的囊狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是一種分子排列有序的近晶型液晶。脂質(zhì)體的主要成分是磷脂，如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺等。 制備方法：有超聲波法、機(jī)械振蕩法、透析法、融合法以及逆向蒸發(fā)法等。 （二）脂質(zhì)體與細(xì)胞的相互作用 脂質(zhì)體作為載體的機(jī)理: :與細(xì)菌球質(zhì)體的作用是相似的，它能將 DNA 包埋在里邊，在 PEG 誘導(dǎo)下，通過細(xì)胞的吞噬或融合作用將內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，最終與受體核 DNA 結(jié)合。脂質(zhì)體與細(xì)胞的相互作用主

24、要有以下幾種形式： 1. 內(nèi)吞作用2. 融合作用3. 交換作用 優(yōu)點(diǎn)：使包裝在里邊的物質(zhì)（質(zhì)粒或 DNA）能避開核酸酶的降解，對(duì)受體無毒性，易被吸收，運(yùn)送率高，轉(zhuǎn)化率高。更重要的是脂質(zhì)體制備比常用的質(zhì)粒載體要容易得多，價(jià)格低廉，技術(shù)操作也簡(jiǎn)單得多。 第三節(jié) 動(dòng)物基因工程載體整合型：即外源基因通過這種病毒載體整合到宿主細(xì)胞的染色體上，隨著宿主細(xì)胞基因組的復(fù)制而擴(kuò)增。 游離型：或稱病毒顆粒型，攜帶有外源基因的這類載體，本質(zhì)上仍然是一種完整或缺損的病毒，能夠以病毒顆粒的形式在宿主細(xì)胞內(nèi)自行復(fù)制或在輔助病毒的存在下進(jìn)行復(fù)制。 一、SV401、SV40 基因組其基因組為共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈 DNA，只有 5

25、243 個(gè)堿基對(duì)。早期基因：產(chǎn)生 T 和 t抗原復(fù)制起點(diǎn)（ori） 晚期基因：轉(zhuǎn)譯出殼蛋白VP1、VP2、VP32、SV40 的復(fù)制和增殖（1）SV40 感染敏感的猿猴細(xì)胞后，經(jīng)過 812 小時(shí)的潛伏期，脫去外殼，DNA 進(jìn)入細(xì)胞核。（2）首先啟動(dòng)早期轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞質(zhì)中翻譯產(chǎn)生 T和 t 抗原。（3）當(dāng)兩種抗原積累到足夠量時(shí)，DNA 開始復(fù)制，同時(shí)啟動(dòng)晚期轉(zhuǎn)錄，翻譯產(chǎn)生殼蛋白，將DNA 包裝成病毒顆粒。（4）當(dāng)細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒多達(dá) 105 時(shí)，細(xì)胞破裂，釋放出大量病毒顆粒。3、構(gòu)建SV40 克隆載體的基本策略和途徑（1）晚期取代載體將SV40 的晚期基因區(qū)域用合適的限制性酶切割后，即可用外源基因取

26、代切割掉的晚期區(qū)域。 （2）早期取代載體早期取代載體是通過用 EcoRI和NodI雙酶切去掉早期基因區(qū)域，然后用外源基因代替去掉的早期基因區(qū)域而獲得的。 （3）穿梭載體 可以認(rèn)為這種克隆載體是質(zhì)?？寺≥d體的衍生物，由 SV40 的 DNA 片段與質(zhì)粒重組而成。優(yōu)點(diǎn)，如：遺傳背景清楚，容易制備，拷貝數(shù)高，病毒的早期功能及晚期功能都有溫度敏感突變株等。 缺陷： SV40 重組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，隨著病毒的繁殖，細(xì)胞便裂解； 容納外源 DNA 能力較小，如構(gòu)建晚期取代載體時(shí)，去掉一段晚期 DNA 后，插入的外源 DNA不能大于 2500 bp。 存在安全隱患。二、其它病毒載體牛乳頭瘤病毒桿狀病毒，RNA

27、腫瘤病毒、腺病毒，單純皰疹病毒及痘苗病毒等 第一節(jié) 微生物基因工程載體克隆載體（clone vector）：主要是對(duì)目的基因克隆，建立DNA文庫和 cDNA 文庫，其上有復(fù)制子即可；表達(dá)載體（expression vector）：能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動(dòng)子；穿梭載體（shottle vector）：這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。第一節(jié) 微生物基因工程載體克隆載體（clone vector）：主要是對(duì)目的基因克隆，建立DNA文庫和 cDNA 文庫，其上有復(fù)制子即可；表達(dá)載體（expression vector）：能使目的

28、基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動(dòng)子；穿梭載體（shottle vector）：這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。M13 M13 噬菌體產(chǎn)生單雙鏈?zhǔn)删w產(chǎn)生單雙鏈 DNA DNA 的機(jī)制的機(jī)制1、以（+）鏈 DNA為摸板，合成互補(bǔ)（）鏈，該雙鏈稱復(fù)制型 DNA（RFDNA）。2、RFDNA 在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個(gè)細(xì)胞約 200 個(gè)拷貝。3 3、單鏈特異的DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合在（+ +）鏈上，從而阻斷了其互補(bǔ)鏈，即（）鏈的合成，這樣，細(xì)胞就會(huì)不斷的合成（+ +）鏈 DNA DNA 。4 4、游離出來的（+ +）鏈 DNA DNA 先與基因V V的編碼產(chǎn)物形成特異的 DNA-DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，同時(shí)基因V V的蛋白質(zhì)從（+ +）DNA DNA 鏈上脫落下來，余下的 M13M13（+ +）鏈 DNA DNA 則是從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。 M13 M13 噬菌體產(chǎn)生單雙鏈?zhǔn)删w產(chǎn)生單雙鏈 DNA DNA 的機(jī)制的機(jī)制1、以（+）鏈 DNA為摸板，合成互補(bǔ)（）鏈，該雙鏈稱復(fù)制型 DNA（RFDNA）。2、RFDNA 在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個(gè)細(xì)胞約 200 個(gè)拷貝。3 3、單鏈特異的DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合在（+