基因克隆操作過(guò)程

1、基因克隆操作過(guò)程基因克隆操作過(guò)程概述基因克隆操作過(guò)程概述1.DNA的體外重組酶切和連接（切、接切、接）2.重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增轉(zhuǎn)、增）3.轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢檢）2011-10-231切接檢轉(zhuǎn)增restriction endonucleaseDNA ligase2011-10-232基因克隆操作過(guò)程一、一、DNA的體外重組（的體外重組（切與接切與接）2011-10-233基因克隆操作過(guò)程1.DNA的體外重組（一）切 工具：限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease） 作用對(duì)象：目的基因片段、載體 目的：獲得具有互補(bǔ)粘性末端（或平末端）的線(xiàn)性目的基因片段和

2、線(xiàn)性化載體2011-10-234基因克隆操作過(guò)程5基因克隆操作過(guò)程Hind IIIEcoR IPvu II 2011-10-236基因克隆操作過(guò)程雙酶聯(lián)合酶切所使用的buffer（Takara）各種限制酶酶切反應(yīng)所使用的buffer（Takara）2011-10-23單酶切實(shí)例（Takara）2011-10-237基因克隆操作過(guò)程雙酶聯(lián)合酶切實(shí)例（Takara）2011-10-238基因克隆操作過(guò)程2. DNA的體外重組（二）接 工具：DNA連接酶（DNA ligase） 作用對(duì)象：具有互補(bǔ)粘性末端（或平末端）的線(xiàn)性目的基因片段和線(xiàn)性化載體 目的：獲得含有目的基因的環(huán)狀載體2011-10-23

3、9基因克隆操作過(guò)程2011-10-235 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGEcoRI退火退火T4-DNA ligasea)獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物；b)需要鑒定目的基因的連接方向（1）單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接）單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接10基因克隆操作過(guò)程 同尾酶：能切割產(chǎn)生相同末端

4、的限制性?xún)?nèi)切酶。 同尾酶一般是指能產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。所有鈍末端酶產(chǎn)生的末端均是相同的，但一般不作為同尾酶來(lái)研究。 同尾酶是不同的酶，它們只是切割DNA產(chǎn)生的末端相同，同尾酶之間的識(shí)別序列可以相同也可以不同 基因工程中識(shí)別序列不同的同尾酶的應(yīng)用性最大 （2）同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接）同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接Takara網(wǎng)站提供的同尾酶信息網(wǎng)站提供的同尾酶信息2011-10-2311基因克隆操作過(guò)程5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGAT

5、CCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGTBclIBamHI退火退火T4-DNA ligasea)獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物；獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物；b)需要鑒定目的基因的連接方向；需要鑒定目的基因的連接方向；c)目的產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)位置的序列不再是原來(lái)的酶切位點(diǎn)目的產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)位置的序列不再是原來(lái)的酶切位點(diǎn)2011-10-2312基因克隆操作過(guò)程5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 G

6、ACGTC3 CGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 3 切平5 CG5 GC補(bǔ)平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC（3）不同粘性末端的連接）不同粘性末端的連接PstIBamHIT4-DNA polymeraseKlenowT4-DNA ligasea)獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物；獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物；b)需要鑒定目的基因的連接方向；需要鑒定目的基因的連接方向；c)目的產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)位置的序列不再是原來(lái)的酶切位點(diǎn)目的產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)位置的序列不再是原來(lái)的酶切位點(diǎn)2011-10-2313基

7、因克隆操作過(guò)程（4）雙酶聯(lián)合酶切產(chǎn)生的不同粘性末端的連接）雙酶聯(lián)合酶切產(chǎn)生的不同粘性末端的連接CTGCAGNNNNNNNNNGGATCCGACGTCNNNNNNNNNCCTAGGPstICTGCA GATCCG GBamHIGGATCC CTGCAGCCTAGG GACGTCPstIBamHI GATCC CTGCA G G退火退火CTGCA G G GATCCG ACGTC CCTAG G T4-DNA ligaseCTGCAG GGATCCGACGTC CCTAGG a)連接產(chǎn)物中目的基因的方向是確定的。連接產(chǎn)物中目的基因的方向是確定的。2011-10-2314基因克隆操作過(guò)程基因克隆操作

8、過(guò)程5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCG5 55GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGKlenow補(bǔ)平補(bǔ)平Kleno

9、w補(bǔ)平補(bǔ)平TdTdGTPTdTdCTP退火退火T4-DNA ligase（5）人工粘性末端的連接：）人工粘性末端的連接：5突出末端突出末端獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物EcoRIBamHIBamHIBamHI2011-10-2315CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGGCATGCCCCCC 3CC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGA

10、CGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火退火KlenowT4-DNA ligase（6）人工粘性末端的連接：）人工粘性末端的連接：3突出末端突出末端獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物SphIPstIPstIPstI2011-10-2316基因克隆操作過(guò)程C 3

11、GG5 G 3C5C3 GGTTTTTTTTTT 3CC3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGGTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGTTdTdTTPTdTdATP退火退火T4-DNA ligase加熱加熱S1 nuclease（7）人工粘性末端的連接：平頭末端）人工粘性末

12、端的連接：平頭末端2011-10-2317基因克隆操作過(guò)程5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseGATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5 5GGAATTCCCCTTAAGGBamHIKlenow補(bǔ)平補(bǔ)平（8）粘性末端的更換）粘性末端的更換EcoRI linkerEcoRI2011-10-2318基因克隆操作過(guò)程n重組率重組率l重組率的定義：含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)。 （1）在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%； （2）重組率是衡量連接反

13、應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以 大大簡(jiǎn)化DNA重組的后續(xù)操作。l提高重組率的方法（1）提高外源DNA片段與載體的分子比：5 : 1 - 10 : 1（2）載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：防止載體自連堿性磷酸單酯酶CIP、BAP：催化核酸分子脫掉5磷酸基團(tuán)2011-10-2319基因克隆操作過(guò)程CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGGCATGCCCCCC 3CC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG

14、5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火退火KlenowT4-DNA ligase（3）加裝同聚尾末端：2011-10-2320基因克隆操作過(guò)程DNA ligase介導(dǎo)的體外連接實(shí)例（介導(dǎo)的體外連接實(shí)例（Takara）2011-10-2321基因克隆操作過(guò)程二、重組二、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）（轉(zhuǎn)與增）2011-10-2322基因克隆操作過(guò)程1.轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)（1）Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化原理

15、：Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立。其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)。處于感受態(tài)的細(xì)菌，容易接受外源DNA。2011-10-2323基因克隆操作過(guò)程2+分子克隆第三版分子克隆第三版OD600=0.4左右左右2011-10-2324基因克隆操作過(guò)程分子克隆第三版分子克隆第三版2011-10-2325基因克隆操作過(guò)程Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng) 轉(zhuǎn)化所用DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%； 熱擊過(guò)程中不要搖晃離心管； 檢測(cè)轉(zhuǎn)化子的Amp抗性時(shí)，

16、轉(zhuǎn)化子鋪平板時(shí)密度應(yīng)低一些（104菌落/板）；轉(zhuǎn)化子于37培養(yǎng)不要超過(guò)20小時(shí)。因?yàn)殇伆暹^(guò)密或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)久會(huì)導(dǎo)致平板上出現(xiàn)對(duì)Amp敏感的衛(wèi)星菌落。 轉(zhuǎn)化過(guò)程中37溫育菌體使細(xì)菌復(fù)蘇時(shí)的轉(zhuǎn)速不可過(guò)高，為得到較高的轉(zhuǎn)化效率，應(yīng)使轉(zhuǎn)速小于225rpm。 當(dāng)用于涂板的轉(zhuǎn)化液過(guò)多時(shí)，應(yīng)離心濃縮（4100rpm，5min），并用適量SOC液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀后涂板。 剛進(jìn)行完轉(zhuǎn)化的菌體比較脆弱，涂板時(shí)應(yīng)輕輕涂布。2011-10-2326基因克隆操作過(guò)程提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)重要因素： l 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于的培養(yǎng)菌，最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的

17、菌液。 細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來(lái)控制。DH5菌株的OD600 為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。2011-10-2327基因克隆操作過(guò)程l質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋DNA(cccDNA)。 轉(zhuǎn)化效率與外源DNA濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。 1ng的cccDNA即可使50l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5。 2011-10-2328基因克隆操

18、作過(guò)程l試劑的質(zhì)量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的，并用超純水配制（過(guò)濾除菌，非高壓滅菌），最好分裝保存于干燥的冷暗處（冰箱4）。l防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, 槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選和鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。 2011-10-2329基因克隆操作過(guò)程2011-10-2330基因克隆操作過(guò)程（2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 適用對(duì)象：革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等），其接納外源DNA的主要屏障

19、是細(xì)胞壁，因而這類(lèi)細(xì)菌通常去除細(xì)胞壁后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這與酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞等類(lèi)似。 細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同。以鏈霉菌為例，細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無(wú)水、無(wú)去污劑。 細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：由PEG和Ca2+介導(dǎo) 細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素。（3）噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染 感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)：將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和M

20、gCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 = 0.5 吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30保溫10分鐘 轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選。2011-10-2331基因克隆操作過(guò)程（4）電穿孔轉(zhuǎn)化 原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 特點(diǎn)：電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。2011-10-2332基因克隆操作過(guò)程（5）酵母的轉(zhuǎn)化一般

21、有以下兩種方法：利用酵母的原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化 利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化（6）植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其他基因轉(zhuǎn)移方法葉盤(pán)法 電擊法 基因槍法 （7）哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因?qū)敕姿徕}沉淀法 脂質(zhì)體載體法顯微注射法DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染技術(shù) 2011-10-2333基因克隆操作過(guò)程2.轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率（1）轉(zhuǎn)化率的定義）轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，能夠接納DNA的受體細(xì)胞數(shù)目，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞無(wú)

22、法生長(zhǎng)）。2011-10-2334基因克隆操作過(guò)程例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108 ，即每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.41011個(gè)分子，也就是說(shuō)，每3400個(gè)pUC18分子中才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞。另一方面，在實(shí)際操作過(guò)程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2mL感受態(tài)細(xì)胞，大約含有21010 個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說(shuō)，每200個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18 DNA。2011-10-2335基因克隆操作過(guò)程（2）轉(zhuǎn)化率的用途）轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為

23、107/g載體，經(jīng)切、接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：104 /（107/gX 10-2）= 0.1 g 載體DNA考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：0.1 / 20% = 0.5 g 載體DNA載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10 1的要求算出（5 g），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選。2011-10-2336基因克隆操作過(guò)程（3）轉(zhuǎn)化率的影響因素）轉(zhuǎn)化率的影響因素l載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載

24、體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。l插入片段的大?。簩?duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低。l受體細(xì)胞：受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高。2011-10-2337基因克隆操作過(guò)程l供體、受體的比例：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 0.1ml 感受態(tài)細(xì)胞 50ng DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 109 個(gè)原生質(zhì)體 50ng DNAl轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化：106-107/g DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：105-106/g DNA -DNA轉(zhuǎn)染： 107-108/g DNA 電穿孔轉(zhuǎn)化： 10

25、6-109/g DNA3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增（1）擴(kuò)增操作）擴(kuò)增操作轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，37培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過(guò)程；噬菌體轉(zhuǎn)染后，30培養(yǎng)10min等，均屬擴(kuò)增操作。（2）擴(kuò)增操作的目的）擴(kuò)增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序；擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選；表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定。2011-10-2338基因克隆操作過(guò)程三、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）三、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各

26、種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。2011-10-2339基因克隆操作過(guò)程1.載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)（1）抗藥性篩選法）抗藥性篩選法將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)：非轉(zhuǎn)化子呈 Ampr、Tcr轉(zhuǎn)化子呈 Ampr、Tcs2011-10-2340基因克隆操作過(guò)程Apl抗藥性篩選法的基本操作：抗藥性篩選法的基本操作：先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Amp的平板；再將Amp平板上的菌落影印影印至含有Amp和Tc的平板上；在Amp平板上生長(zhǎng)、但在Amp和Tc平板上不長(zhǎng)的菌落即為轉(zhuǎn)化子。挑選影印Ap + Tc2011-10-2341基因克隆操作過(guò)程（2）營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法）營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選

27、法的基本原理：載體分子上攜帶某種營(yíng)養(yǎng)組分的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組分，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組分的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子。常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記：（1）用于大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因trp； （2）用于高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型。2011-10-2342基因克隆操作過(guò)程（3）顯色篩選法）顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：載體分子上攜帶某種酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ基因（編碼半乳糖苷酶，藍(lán)色反應(yīng)藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌

28、質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（編碼酪氨酸酶，黑色反應(yīng)黑色反應(yīng)）等。2011-10-2343基因克隆操作過(guò)程l顯色篩選法的基本操作：顯色篩選法的基本操作：將外源基因克隆在pUC18的lacZ標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)轉(zhuǎn)化子為Ampr、lacZ-，呈淡黃色或白色菌落；而非轉(zhuǎn)化子則為Ampr、lacZ+，呈藍(lán)色菌落藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選。IPTG：異丙基-D-硫代半乳糖苷；X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷, 是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的顯色底物2011-10-2344基因克隆操作過(guò)程2.克隆克隆DNA序列檢測(cè)序列檢測(cè)（1）限制性酶切圖譜法）限制性酶切圖譜法

29、所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，從而有效地鑒定轉(zhuǎn)化子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。2011-10-2345基因克隆操作過(guò)程用用BamHI酶切待鑒定菌落的質(zhì)粒酶切待鑒定菌落的質(zhì)粒DNA，電泳觀察酶解產(chǎn)物片段。，電泳觀察酶解產(chǎn)物片段。 轉(zhuǎn)化子：2.7 kb + 4.0 kb非轉(zhuǎn)化子： 2.7 kb如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線(xiàn)性化，然后通過(guò)其長(zhǎng)度來(lái)鑒定其是否為轉(zhuǎn)化子。2011-10-2346基因克隆操作過(guò)程用用EcoRI酶切待鑒定菌落的質(zhì)粒酶切待鑒定菌落的

30、質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化子： 3.0 kb + 3.7 kb 或1.0 kb + 5.7 kb用用PstI酶切帶鑒定菌落的質(zhì)粒酶切帶鑒定菌落的質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化子： 3.2 kb + 3.5 kb 或0.8 kb + 5.9 kb2011-10-2347基因克隆操作過(guò)程（2）菌落）菌落/噬菌斑原位雜交法噬菌斑原位雜交法菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計(jì)并合成探針，以此篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù)。2011-10-2348基因克隆操作過(guò)程菌落原位雜交法的基本操作：菌落原位雜交法的基本操作：用硝酸纖維

31、素薄膜影印克隆平板；用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜；用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜；80烘干固定影印薄膜；薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫；用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜；用X光膠片覆蓋薄膜感光。2011-10-2349基因克隆操作過(guò)程（3）DNA序列分析法序列分析法DNA序列測(cè)定是精確鑒定目的基因的重要手段；通過(guò)序列比對(duì)軟件分析確定轉(zhuǎn)化子：DNAMAN、Blast、ClustalW2011-10-2350基因克隆操作過(guò)程DNADNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例2011-10-2351基因克隆操作過(guò)程3.外源基因產(chǎn)物檢測(cè)外源基因產(chǎn)物檢測(cè)（1）蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法）蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法a

32、)淀粉酶目的基因的鑒定：淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶于水的淀粉加入固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基呈混濁狀。將待鑒定的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的轉(zhuǎn)化子可表達(dá)淀粉酶并分泌到胞外，均勻擴(kuò)散，降解淀粉為可溶性的多糖或單糖。因此，轉(zhuǎn)化子菌落周?chē)鷷?huì)形成透明圈。如果透明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴灑碘液，使淀粉所在區(qū)域呈藍(lán)色本底，易于辨認(rèn)。b)蛋白酶、脂肪酶目的基因的鑒定：方法與上類(lèi)似蛋白酶：水解酪蛋白脂肪酶：水解甘油酯2011-10-2352基因克隆操作過(guò)程c)抗生素抗性基因的鑒定：抗生素抗性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)該抗生素的抗性。據(jù)此，只需往培養(yǎng)板中加入適量抗生素，理論上長(zhǎng)出的菌落即

33、是含有目的基因的轉(zhuǎn)化子。 氨芐青霉素：Amp或Ap 卡那霉素：Kan 壯觀霉素：Sp 四環(huán)素：Tc在實(shí)際操作過(guò)程中，由于抗生素有時(shí)會(huì)誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生抗性，因此必須從抗性重組克隆中抽出重組質(zhì)粒，二次轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。如果此時(shí)轉(zhuǎn)化平板上出現(xiàn)大量的抗性菌落，即可認(rèn)為這種抗性確由目的基因的編碼產(chǎn)物產(chǎn)生。2011-10-2353基因克隆操作過(guò)程（2）蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法）蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法免疫沉淀鑒定：免疫沉淀鑒定：在瓊脂培養(yǎng)基中加入目標(biāo)蛋白的特異性抗體；然后涂布轉(zhuǎn)化液；經(jīng)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)化子菌落便會(huì)分泌出目標(biāo)蛋白，并與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，在菌落周?chē)纬砂咨膱A斑。白色的圓斑。此法簡(jiǎn)便快速，但靈敏度低，

34、抗體消耗量大。2011-10-2354基因克隆操作過(guò)程（3）聚丙烯酰胺凝膠電泳法）聚丙烯酰胺凝膠電泳法如果待篩選鑒定的目標(biāo)蛋白既不能測(cè)定生物活性，又無(wú)現(xiàn)成的抗體使用，則可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行粗略的篩選。2011-10-2355基因克隆操作過(guò)程 同尾酶：能切割產(chǎn)生相同末端的限制性?xún)?nèi)切酶。 同尾酶一般是指能產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。所有鈍末端酶產(chǎn)生的末端均是相同的，但一般不作為同尾酶來(lái)研究。 同尾酶是不同的酶，它們只是切割DNA產(chǎn)生的末端相同，同尾酶之間的識(shí)別序列可以相同也可以不同 基因工程中識(shí)別序列不同的同尾酶的應(yīng)用性最大 （2）同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接）同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接Takara網(wǎng)站提供的同尾酶信息網(wǎng)站提供的同尾酶信息2011-10-2356基因克隆操作過(guò)程分子克隆第三版分子克隆第三版2011-10-2357基因克隆操作過(guò)