mianyizhuodu解讀

1、免疫濁度分析技術免疫濁度分析技術 信陽職業(yè)技術學院信陽職業(yè)技術學院 藥學與檢驗系藥學與檢驗系 ?20世紀70年代建立。它是將液相內的沉淀試驗與現(xiàn)代光學儀器和自動分析技術相結合的一項分析技術。當可溶性抗原與相應的抗體特異結合，在二者比例合適、并有一定濃度的電解質存在時，可以形成不溶性的免疫復合物，使反應液出現(xiàn)濁度。這種濁度可用肉眼或儀器測知，并可通過濁度推算出復合物的量，即抗原或抗體的量。 免疫濁度測定是定量測定微量抗原物質一種高靈敏度、快速的自動化免疫分析技術 ,其應用廣泛。 ? 免疫濁度分析方法類型免疫濁度分析方法類型 ?一、透射免疫比濁法 二、速率抑制免疫比濁法 三、散射免疫比濁法 四、免

2、疫膠乳濁度測定法 一、透射免疫濁度測定法一、透射免疫濁度測定法 原理：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復合物，使反應液出現(xiàn)濁度。當反應液過量時，形成的復合物隨抗原量的增加而增加，反應液的濁度亦隨之增加，與一系列的標準品對照，即可計算出受檢物質的含量。 技術要點： 1）抗原參考品及待測標本作適當稀釋； 2）將待測標本和標準抗原液（5個濃度）與適當過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應完成后，在340nm處檢測各管吸光度；（ 3）以劑量-反應曲線求得標本中抗原的濃度。 方法評價： ?本法操作簡便，結果準確，能用全自動化或半自動化儀器進行分析。 ?靈敏度低于散射比濁法，但比單擴散法高5-

3、10倍。 ?抗體用量較大，檢測需抗原抗體反應達到平衡，耗時較長。 ?不宜用于藥物半抗原的檢測。 二、散射免疫比濁法 ?1967年Ritchie等利用激光照射在液相中的抗原抗體復合物微粒上時，部分光線發(fā)生散射的原理，通過測量散射光的強度來得知待測抗原的量，這種比濁測定法稱為散射比濁法 1977年Sternberg進一步發(fā)展建立了速率散射比濁法使微量抗原的定量測定得以快速靈敏地進行。 基本原理基本原理 ?散射比濁法是指沿水平軸照射的一定波長的光，通過溶液時光線被免疫復合物粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉，產(chǎn)生散射光。反應溶液中的懸浮分子，無論是固體或膠體粒子都可以是散射中心。當入射光通過時，如果顆粒直徑比入

4、射光的波長小很多（入射光波長的1/101/20），則散射光在各個方向上的分布比較均勻，稱為Rayleigh散射；粒徑與入射光的比例增大，正向散射光強度趨于增強，當粒徑略小于入射光波長時，稱為Debye散射；如果顆粒直徑接近或大于入射光波長時，則散射光呈明顯的不均勻分布，稱為Mile散射。 入射光波長越小，散射光越強； ?散射光強度與粒子的濃度和體積成正比； ?散射光強度隨焦點至檢測器距離的平方和而下降。 因此，在散射比濁中，增加抗原抗體復合物的體積，減少入射光的波長，將檢測點盡可能地接近散射源并選擇合適的檢測夾角，都可使檢測的靈敏度增加。由于散射比濁法測定的是散射光的信號，避免了透射光中所含有

5、的透射、散射甚至折射等雜信號成分的影響，因此，散射比濁法的靈敏性和特異性均好于透射比濁法。 ?散射比濁法類型散射比濁法類型 ?終點散射比濁法 速率散射比濁法 （一）終點散射比濁法（一）終點散射比濁法 ?抗原、抗體相遇后免疫沉淀反應立即開始，但反應達到平衡通常需 1030min。免疫濁度測定應在復合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前進行，否則光散射值降低，影響測定結果。因此，終點散射比濁通常是在免疫反應進行到一定時間時測量其濁度，故亦可稱為定時散射比濁 （二）速率散射比濁法（二）速率散射比濁法 ?速率散射比濁法是一種先進的動力學測定法，1977年由Sternberg首先用于免疫學測定。 所謂速率是指單位時間

6、內抗原與抗體反應的速度。 抗原與抗體結合形成免疫復合物的速度，在每個單位時間內是不相同的，在抗體過量的情況下，隨著反應時間的延長，免疫復合物的總量逐漸增加，通常在 25s時出現(xiàn)一個反應最快的速率峰。峰值與抗原量呈正相關。 抗原抗體反應的速率變化抗原抗體反應的速率變化 散 射 光 強 度 到達峰值時間 time 三、速率抑制免疫比濁法 ?本法是一種競爭性結合或競爭性抑制試驗，主要用于測定半抗原和藥物等小分子物質。試劑中的特異性抗體是由半抗原與載體蛋白偶聯(lián)后，免疫動物制備而成。 試驗時先將一定量的已知半抗原 - 載體（大分子）與限量的特異性抗體發(fā)生反應，生成的免疫復合物可形成一定的速率散射峰值。

7、?當反應系統(tǒng)內加入待檢標本時，其中所含的半抗原（小分子）與抗體競爭結合，使大分子的半抗原 - 載體- 抗體復合物的形成受到抑制，速率散射峰值降低，其降低程度與標本中的待測半抗原（或藥物）成正比，根據(jù)標準曲線可計算出標本中待測物質的含量。 四、免疫膠乳濁度測定法四、免疫膠乳濁度測定法 原理： 將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當遇到相應的抗原時，則使乳膠顆粒發(fā)生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波長之內不阻礙光線透過，兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時，則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳凝集的程度呈正比，當然也與待測抗原量呈正比。 ?五、免疫濁度分析的影響因素五、免疫濁度分析的影響因素 抗原抗體反

8、應的比例 ? 抗體試劑的質量 ? 抗原抗體反應的溶液 ? 增濁劑的作用 ?（一）抗原抗體反應的比例（一）抗原抗體反應的比例 ?濁度法中的免疫反應遵循抗原抗體反應的一般規(guī)律。免疫濁度測定的反應體系中必須始終保持抗體過量，以保證免疫復合物的生成量與濁度的改變一致，這是免疫濁度測定的基本原則。 抗體過剩必須適量，因此實驗中掌握抗體的濃度是個關鍵。 為了減少非特異性濁度（為了減少非特異性濁度（“偽濁度偽濁度”）的出現(xiàn)，）的出現(xiàn)，還應對抗原（待測樣品）進行適當?shù)南♂尅?（二）抗體試劑的質量（二）抗體試劑的質量 ?1抗體的質量：免疫比濁測定法要求抗體的特異性強，效價高，親和力強。 2 抗體的類型 ：根據(jù)抗

9、血清來源的動物種類不同，抗體可分為R型（rabbit type）和H型（horse type）。 R型抗體是用于免疫比濁測定的較為理想的試劑。 （三）抗原抗體反應的溶液（三）抗原抗體反應的溶液 ?反應液對免疫復合物的形成也起重要作用?？乖贵w反應液的最適pH值為6.58.5，超過此限度則不易形成復合物，甚至可引起復合物解離。在一定范圍內，離子強度大，復合物形成快；離子強度過低或無電解質存在，則不易出現(xiàn)可見的沉淀反應。離子的種類也可影響免疫復合物的形成，一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫濁度法的反應液。 （四）增濁劑的作用（四）增濁劑的作用 ?在反應體系中加入某些非離子型親水劑，如聚乙二醇（poly

10、ethylene glycol,PEG）、吐溫-20（tween-20）等，可以促進抗原抗體復合物的形成，增加反應濁度。 以PEG6000為最常用。 全自動的免疫濁度測定儀特點全自動的免疫濁度測定儀特點 ?速率散射或透射比濁； 抗原過剩檢測； 自動控制系統(tǒng)，包括自動稀釋加液和標本、試劑液面感應裝置、試劑冷藏和反應控溫系統(tǒng)； 自動監(jiān)測系統(tǒng)，能對試劑、樣品和儀器狀態(tài)自動監(jiān)測并及時報警； 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，包括數(shù)據(jù)的計算、患者和測試資料的儲存、實時質控等功能； 校準和定標程序。 六、免疫濁度測定法的應用 ?免疫濁度法早期主要用于血清、尿和腦脊液中蛋白質含量的測定。 近年來，隨著免疫濁度測定儀性能的不斷完善，免疫濁度法的檢測范圍不斷擴大。 六、免疫濁度測定法的